氨氯地平下調(diào)oxLDL誘導(dǎo)的HUVEC-12細(xì)胞MCP-1的表達(dá)并抑制其趨化THP-1細(xì)胞.pdf

1、研究背景: MAPK是絲/蘇氨酸蛋白激酶,可被多種細(xì)胞外刺激激活并介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)。P38MAPK是MAPK家族中的重要成員,能被致炎因子如腫瘤壞死因子和氧化低密度脂蛋白等激活,觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而引起炎癥因子分泌,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中具有重要作用。單核細(xì)胞趨化蛋白-1是強(qiáng)有力的趨化因子,在動(dòng)脈粥樣硬化早期募集單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞到血管壁。研究表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MCP-1表達(dá)明顯升高。動(dòng)脈粥樣硬化是慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程,從脂質(zhì)條紋到斑塊破裂與血栓

2、形成過(guò)程中,炎癥反應(yīng)始終貫穿其中。氨氯地平是第三代二氫吡啶類(lèi)鈣通道阻滯劑,廣泛用于治療高血壓。已證實(shí)其能抑制人與動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,其機(jī)制可能與如改善內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和抗氧化應(yīng)激等作用相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬觀察氨氯地平對(duì)oxLDL誘發(fā)的HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)及對(duì)THP-1單核細(xì)胞趨化作用的影響。
　　目的:從炎癥反應(yīng)角度,觀察氨氯地平對(duì)oxLDL誘發(fā)的HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)及對(duì)THP-1

3、單核細(xì)胞趨化作用的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討,為氨氯地平抗As提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.不同濃度(0、25、50、100 mg/L)oxLDL與HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞孵育24h,50 mg/L oxLDL與HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞孵育不同時(shí)間(0、3、6、12、24h)后,Western blot與RT-PCR分別檢測(cè)細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平及MCP-1 mRNA的表達(dá),篩選出最佳處理濃度與時(shí)間。
　　2

4、.不同濃度氨氯地平(0、0.1、1.0、10.0μM)預(yù)孵育 HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞1h后,與50mg/LoxLDL共同孵育24h,Western blot與 RT-PCR分別檢測(cè)細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平及MCP-1 mRNA的表達(dá),ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中MCP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　3.10.0μM氨氯地平預(yù)孵育HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞1h和20μM p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)孵育HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞3

5、0分鐘后,與50 mg/L oxLDL共同孵育24h,Western blot與 RT-PCR分別檢測(cè)細(xì)胞 p38MAPK磷酸化水平及 MCP-1 mRNA的表達(dá),ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中MCP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　4.將HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞種于Transwell下室,50mg/L oxLDL處理細(xì)胞24小時(shí),然后在上室種THP-1單核細(xì)胞,4小時(shí)后計(jì)數(shù)下室的THP-1單核細(xì)胞數(shù)。將HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞種于Transw

6、ell下室,用10.0μM氨氯地平預(yù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí),20μM SB203580預(yù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞30分鐘,再將THP-1細(xì)胞種到上室,4小時(shí)后計(jì)數(shù)下室的THP-1單核細(xì)胞數(shù),觀察THP-1單核細(xì)胞趨化的情況。
　　結(jié)果:
　　1.OxLDL在0-100mg/L的濃度范圍內(nèi),隨 oxLDL濃度增加,p-p38MAPK和MCP-1mRNA的表達(dá)隨之上調(diào),濃度為50mg/L時(shí),p38MAPK磷酸化水平及MCP-1mRNA的表達(dá)達(dá)峰

7、值,濃度為100mg/L時(shí),表達(dá)下降。50mg/L的oxLDL與HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞孵育0-24h內(nèi),呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)MCP-1mRNA的表達(dá),p38MAPK磷酸化水平在3h達(dá)峰值,此后維持在這一水平。
　　2.不同濃度氨氯地平預(yù)孵育HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞1h后,與oxLDL共同孵育24h,p38MAPK磷酸化水平及MCP-1的表達(dá)下降,并呈量效關(guān)系。
　　3.10.0μM氨氯地平和20μM p38MAPK抑制劑SB2

8、03580預(yù)孵育HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞后,與oxLDL共同孵育24h,p38MAPK磷酸化水平及MCP-1的表達(dá)明顯降低,氨氯地平與SB203580單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí),兩者的表達(dá)沒(méi)有明顯改變。
　　4.將HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)種到transwell下室并用oxLDL處理細(xì)胞后,對(duì)THP-1單核細(xì)胞的趨化作用明顯增強(qiáng)。當(dāng)用10.0μM氨氯地平與20μMSB203580預(yù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞后,對(duì)THP-1單核細(xì)胞的趨化作用卻明顯減弱。