SERPINA3K對(duì)翼狀胬肉原代細(xì)胞的增殖遷移能力的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：氧化應(yīng)激為眼表常見病翼狀胬肉的主要發(fā)病機(jī)制之一。最近研究表明，Wnt信號(hào)通路也跟翼狀胬肉的發(fā)病有密切關(guān)系。本課題主要研究SERPINA3K對(duì)胬肉原代細(xì)胞的增值和遷移的抑制作用，探究其作用機(jī)制，為臨床上胬肉疾病的治療提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：將新鮮的翼狀胬肉組織塊在顯微鏡下分離，分成上皮部分和基質(zhì)部分。采用組織塊方法分別培養(yǎng)，待培養(yǎng)出的胬肉上皮細(xì)胞和胬肉成纖維細(xì)胞長(zhǎng)到80％時(shí)，傳代并分組，分為SERPINA3K處理組（

2、加SERPINA3K組）和不處理組（對(duì)照組）。采用CCK8法來檢測(cè)胬肉原代細(xì)胞的增殖情況;采用劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)胬肉原代細(xì)胞的遷移情況;采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitativeReal-timeRT-PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)和免疫熒光染色(immunofluorescentstaining)等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)與氧化應(yīng)激相關(guān)的因子如NOX4、SOD2、NRF2、NQO1、catalase和GST

3、P的變化情況以及Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子的基因表達(dá)水平以及蛋白水平如n-p-β-catenin、β-eatenin、LRP6。
　　 結(jié)果：與正常結(jié)膜相比，3-NT、NOX4在翼狀胬肉中表達(dá)量顯著下降，提示胬肉處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。用組織塊培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)出胬肉上皮細(xì)胞和胬肉成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)出的細(xì)胞傳代，加SERPINA3K處理。從CCK8和劃痕實(shí)驗(yàn)可以觀察到，SERPINA3K能抑制胬肉原代細(xì)胞的增殖和遷移，并且在胬肉上皮細(xì)胞中表現(xiàn)

4、更為明顯，胬肉上皮細(xì)胞的增殖標(biāo)志物Ki67表達(dá)量下降。在胬肉兩種不同細(xì)胞中，其作用機(jī)制不完全相同。在胬肉上皮細(xì)胞中，SERPINA3K明顯降低與活性氧物質(zhì)(ROS)生成相關(guān)因子NOX4的水平和與Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子n-p-β-catenin、β-catenin、LRP6的水平，而使抗氧化因子SOD2、NRF2和NQO1水平升高。SERPINA3K也使胬肉成纖維細(xì)胞中NOX4、β-catenin水平下降，而抗氧化因子SOD2、NRF2、

5、catalase和GSTP水平明顯升高，而與Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子n-p-β-catenin、LRP6的表達(dá)水平不穩(wěn)定。
　　 結(jié)論：SERPINA3K顯著抑制胬肉原代細(xì)胞的增殖和遷移能力。SERPINA3K對(duì)胬肉原代細(xì)胞的作用機(jī)制可能有以下兩方面:一方面SERPINA3K抑制胬肉原代細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的激活;另一方面SERPINA3K通過調(diào)節(jié)活性氧物質(zhì)(ROS)系統(tǒng)，即抑制ROS的生成和促進(jìn)ROS的降解。本實(shí)驗(yàn)首次研究了SE