BlimplmRNA在RA患者外周單個核細(xì)胞的表達(dá)及IL-21對其調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、背景與目的：
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以對稱性滑膜關(guān)節(jié)炎進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征，在成人中發(fā)病率達(dá)0.5％。RA患者滑膜易形成濾泡外生發(fā)中心，進(jìn)而B細(xì)胞在局部炎癥中發(fā)揮作用并產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞，這些局部反應(yīng)引起免疫系統(tǒng)活化最終導(dǎo)致RA患者關(guān)節(jié)破壞。過去的幾十年里普遍認(rèn)為RA主要由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)，二者是RA病理生理改變的主要參與者，最

2、近抗-CD20抗體如利妥昔單抗治療誘導(dǎo)B細(xì)胞清除對難治性RA患者的顯著臨床療效表明B細(xì)胞是RA發(fā)病機(jī)制的主要參與者。作為近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種T細(xì)胞亞群，Tfh細(xì)胞(T follicular helper cells，濾泡輔助T細(xì)胞)參與了自身免疫性疾病的發(fā)病，研究發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)了生發(fā)中心（germinal center,GC）的自發(fā)形成和高親和力自身抗體的異常陽性選擇。該細(xì)胞可通過CD40L傳遞輔助信號，其與B細(xì)胞的直接接觸引起CD40L-C

3、D40結(jié)合，進(jìn)而引起B(yǎng)細(xì)胞NF-kB活化和IRF4(Interferon regulatory factor 4，白介素調(diào)節(jié)因子4)上調(diào)，IRF4反過來下調(diào)BCL6(B-cell lymphoma 6 protein，B細(xì)胞淋巴瘤蛋白6)進(jìn)而為GC后B細(xì)胞分化創(chuàng)造條件，此外也通過產(chǎn)生IL-21（Interlukin 21，白介素21）等細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)作用。IL-21能夠直接作用于B細(xì)胞控制GC形成并通過活化STAT3（Signal

4、transducer and activator of transcription 3，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3）促進(jìn)B細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞，其能否通過作用于其他下游信號分子參與漿細(xì)胞發(fā)育值得進(jìn)一步探索。作為漿細(xì)胞發(fā)育的三個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（STAT3，IRF4，Blimp1）之一，B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1（B lymphocyte induced maturation protein l，Blimp1）在B細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞和漿細(xì)胞分泌

5、高水平免疫球蛋白過程中發(fā)揮關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，但其在自身免疫病領(lǐng)域研究較少，而IL-21對其是否存在調(diào)節(jié)作用也有待研究。本實驗研究IL-21、Blimp1 mRNA在RA患者體內(nèi)的表達(dá)及IL-21對體外培養(yǎng)RA患者外周單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)Blimp1表達(dá)和B細(xì)胞CD20表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索IL-21參與RA發(fā)病的具體作用機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1

6、.選取2012年10月至2013年3月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科住院的30例RA患者和30名健康體檢人員作為實驗對象。
　　2.采用ELISA方法檢測RA患者和健康對照血漿IL-21水平;同時檢測記錄患者臨床指標(biāo)DAS28和抗CCP抗體同其IL-21水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3.實時熒光定量PCR(QTR-PCR)檢測RA患者PBMCsBlimp1 mRNA表達(dá)水平，同健康對照進(jìn)行比較分析。
　　4.分離PBMCs進(jìn)

7、行體外培養(yǎng)，設(shè)立陰性對照組、CD40L組、IL-21組和CD40L加IL-21組，以IL-21和/或CD40L刺激細(xì)胞72小時后實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞Blimp1mRNA表達(dá)水平并進(jìn)行組間比較。
　　5.分離PBMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，設(shè)立陰性對照組、CD40L組、IL-21組和IL-21加CD40L組，以IL-21或CD40L刺激細(xì)胞96小時后流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞CD20陽性B細(xì)胞所占比例。
　　結(jié)果：
　　1

8、.同健康對照(21.26±6.35ng/L)比較，RA患者血清IL-21水平(126.31±12.68ng/L)明顯升高(t=-23.185，P＜0.05)，且IL-21水平同RA患者DAS28(r=0.102)和抗CCP抗體(r=0.083)具有相關(guān)性(P＜0.05）。
　　2.RA患者PBMCsBlimp1mRNA表達(dá)水平(1.216±0.21)明顯高于健康對照(1.000±0.00)(Z=-2.41,P＜0.05)。

9、　　3.對照組(1.000±0.000)和CD40L組(1.008±0.027)Blimp1mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異，IL-21組(1.084±0.029)和CD40L加IL-21組(1.157±0.028)Blimp1mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組(P＜0.05），CD40L加IL-21組Blimp1mRNA表達(dá)水平高于IL-21組（P＜0.05）。
　　4.CD40L組(2.42±0.35)、IL-21組(2.63±0.3

10、3)和IL-21加CD40L組(5.60±0.42)較陰性對照組(1.62±0.14)CD20陽性B細(xì)胞比例(％)增加，IL-21加CD40L組較CD40L組和IL-21組CD20陽性B細(xì)胞比例增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　RA患者IL-21水平較健康對照升高，且同患者疾病活動指標(biāo)DAS28評分和抗CCP抗體水平相關(guān)，因此IL-21可能參與了RA的發(fā)病過程且與漿細(xì)胞功能有關(guān);RA患者PBMCs