4-1BBL基因轉(zhuǎn)染對小鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞生長的影響及其免疫調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的：初步探討轉(zhuǎn)染4-1BBL基因的小鼠卵巢癌細(xì)胞株OVHM細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的致瘤性及其對免疫功能的影響。 方法：以脂質(zhì)體為載體將重組質(zhì)粒pcDNA3．1和pcDNA3．1/4-1BBL分別轉(zhuǎn)染小鼠卵巢癌細(xì)胞株OVHM。設(shè)定藥物濃度梯度，確定Hygro B對OVHM細(xì)胞株的最適藥物濃度（800 μg/ml），以此藥物濃度維持培養(yǎng)經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞10天后，改為半量藥物繼續(xù)維持培養(yǎng)（400μg/ml），轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞逐漸形成單細(xì)胞克隆

2、，篩選出抗性單克隆多個(gè)，分別培養(yǎng)。采用RT-PCR及流式技術(shù)方法檢測抗性單克隆細(xì)胞中目的基因4-1BBL的表達(dá)，篩選建立穩(wěn)定高表達(dá)4-1BBL的陽性細(xì)胞株OVHM/4-1BBL。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為OVHM/pcDNA3．1（具有Hygro B抗性，但是4-1BBL表達(dá)較野生型細(xì)胞株沒有增加）。采用計(jì)數(shù)法繪制體外培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線，觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞體外生長有無變化，以了解基因?qū)?xì)胞自身生長有無影響。本實(shí)驗(yàn)將18只6～8周齡的雌性B6C3F1小鼠

3、隨機(jī)分為3組，每組6只小鼠，分別接種OVHM細(xì)胞，OVHM/pcDNA3．1細(xì)胞，OVHM/4-1BBL細(xì)胞于小鼠腹部皮下（1×106/200μl），觀察細(xì)胞在各組小鼠體內(nèi)的致瘤性，監(jiān)測各組腫瘤的生長速度及腫瘤體積。于細(xì)胞接種后第21天處死各組小鼠，取其瘤體做病理切片H&E染色。無菌操作取其脾臟，制備CTL細(xì)胞懸液為效應(yīng)細(xì)胞，以野生型OVHM細(xì)胞株為靶細(xì)胞，以LDH法測定4-1BBL對CTL細(xì)胞殺傷活性的影響。 結(jié)果：成功轉(zhuǎn)染O

4、VHM細(xì)胞株，建立了高表達(dá)4-1BBL基因的OVHM/4-1BBL細(xì)胞株。與野生型小鼠卵巢癌細(xì)胞株OVHM相比，本實(shí)驗(yàn)所建立的OVHM/4-1BBL細(xì)胞株可穩(wěn)定高表達(dá)目的基因4-1BBL（IA百分比為77．82±3．45），而OVHM/pcDNA3．1細(xì)胞株中4-1BBL基因的表達(dá)與野生型OVHM細(xì)胞株無顯著性差異（其IA百分比分別為22．56±2．07和21．63±1．61）。轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞的體外生長曲線相似，各細(xì)胞體外生長速度無顯

5、著性變化（F=0，P>0．05）。通過小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OVHM/4-1BBL細(xì)胞株在B6C3F1雌性小鼠體內(nèi)的致瘤性較野生型OVHM細(xì)胞株和OVHM/pcDNA3．1細(xì)胞顯著性降低，且其成瘤時(shí)間較晚，腫瘤生長速度顯著減慢（P<0．05），且OVHM/4-1BBL組小鼠均未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，而其余兩組小鼠均可有腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象出現(xiàn)，且兩組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移無明顯差異。經(jīng)過腫瘤標(biāo)本的病理切片H&E染色可證實(shí)，轉(zhuǎn)移瘤體與原發(fā)瘤的同源性。本

6、實(shí)驗(yàn)通過LDH方法測定CTL細(xì)胞殺傷活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-1BBL組小鼠的CTL細(xì)胞殺傷活性較其余兩組小鼠有顯著性增強(qiáng)（P<0．05），余兩組小鼠的CTL細(xì)胞殺傷活性則無顯著性變化（P>0．05）。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染4-1BBL基因?qū)VHM細(xì)胞的體外生長沒有明顯影響，但可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤免疫，使腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤性顯著降低，腫瘤生長速度顯著減慢，4-1BBL可以增強(qiáng)CTL細(xì)胞的殺傷活性可能與其有關(guān)，有關(guān)具體機(jī)制還有待進(jìn)一步