核受體LXR對損傷血管內皮修復的影響及機制研究.pdf

1、1.研究背景
　　 血管內皮損傷是介入術后的血栓形成和血管再狹窄的關鍵，也是高血壓、動脈粥樣硬化和糖尿病血管病變等多種血管損傷性疾病共同的病理生理基礎。血管損傷后的內皮再生修復可以有效防止血栓形成和抑制血管平滑肌細胞的異常增生，因此，盡早促進損傷血管的再內皮化、恢復血管內皮功能，是防止介入術后血栓形成和血管再狹窄，預防和治療血管損傷性疾病的有效策略。
　　 肝X受體(liver X receptor，LXR)是配體激活的

2、核受體超家族成員，被其內源性配體/合成激動劑激活后，可以通過調節(jié)一系列靶基因的轉錄，參與調節(jié)膽固醇代謝、糖代謝和炎癥反應。近來的研究發(fā)現，LXR在心腦血管疾病防治中可能發(fā)揮著一定的作用：
　　 (1)LXR激動劑可以明顯抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程；
　　 (2)LXR激動劑可以顯著抑制血管損傷后的新生內膜形成；
　　 (3)LXR激動劑可以促進缺血腦組織的新生血管形成。
　　 損傷血管內皮的再生是上述

3、心腦血管疾病防治的共同環(huán)節(jié)，因此我們設想，LXR激活后是否可以通過促進血管內皮的再生，從而發(fā)揮對上述病理生理過程的調節(jié)作用?
　　 在預實驗中，我們采用小鼠頸動脈損傷模型觀察LXR對損傷血管的內皮再生的影響，結果顯示，LXR激動劑T0901317干預后，小鼠的損傷頸動脈的再內皮化面積明顯增加。那么LXR激活后又是如何促進損傷血管內皮的再生修復呢?血管內皮的再生
　　 依賴于：
　　 (1)鄰近內皮細胞(endot

4、helial cells，ECs)的增殖和遷移；
　　 (2)骨髓、脾臟等來源的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，EPCs能從骨髓、脾臟等動員到外周血，遷移、歸巢于血管損傷區(qū)域，增殖和分化為ECs，還可通過旁分泌機制(分泌促血管生成因子)促進鄰近ECs增殖和遷移，從而促進內皮修復。
　　 介于以上的研究背景，我們推測，激活LXR后可能通過調節(jié)ECs與EPCs的生物學功能(如

5、：增殖、遷移能力等)，促進損傷血管內皮的再生與修復。
　　 2.方法
　　 2.1.LXR激動劑對小鼠頸動脈損傷血管內皮修復的影響
　　 構建小鼠頸動脈損傷模型，采用LXR激動劑T0901317[30 mg/(Kg·d)]于術前2天開始喂養(yǎng)小鼠，通過伊文氏藍染色觀察損傷頸動脈再內皮化的情況，以闡明激活內源性LXR對損傷血管內皮修復的影響。
　　 2.2.LXR對內皮細胞的增殖、遷移能力的影響及機制研究

6、r>　　 從健康新生兒臍帶分離和培養(yǎng)原代人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，顯微鏡下觀察HUVECs的形態(tài)學特征，免疫熒光檢測vWF進行內皮細胞鑒定；第3～5代HUVECs用于實驗。
　　 LXR激動劑T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)處理HUVECs后，MTS方法檢測HUVECs的增殖能力，Transwell遷移實驗檢測HUVECs的

7、遷移能力，Western blot檢測P-Akt、總Akt、p-eNOS、總eNOS的表達。
　　 先用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預處理HUVECs30 min后，再用LXR激動劑T0901317干預，MTS方法檢測HUVECs的增殖能力，Transwell遷移實驗檢測HUVECs的遷移能力，Western blot檢測p-Akt、總Akt、p-eNOS、

8、總eNOS的表達。
　　 2.3.LXR對內皮祖細胞的生物學功能的影響及機制探討
　　 選用大鼠骨髓源性內皮祖細胞(BM-EPCs)和小鼠脾源性內皮祖細胞(Spleen-EPCs)這兩種不同種屬和來源的EPCs作為研究模型。密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核
　　 細胞(MNCs)和小鼠脾臟MNCs，誘導分化為EPCs，顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學特征，通過DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I熒光雙染和流式細胞分

9、析檢測細胞分子表面標記進行EPCs的鑒定。培養(yǎng)第5～7天的大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs用于實驗。
　　 采用RT-PCR、western blot和免疫熒光檢測LXRα、LXRβ在大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs中的表達和定位。
　　 LXR激動劑T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)或GW3965(0、0.5、2、5μmol/L)干預EPCs后，MTS方法檢測EPCs的增殖能

10、力，Transwell遷移實驗檢測EPCs的遷移能力，Western blot檢測p-Akt、總Akt、p-eNOS、總eNOS的表達。
　　 先用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預處理EPCs30 min后，再用LXR激動劑T0901317或GW3965干預，MTS方法檢測BM-EPCs的增殖能力，Transwell遷移實驗檢測EPCs的遷移能力，Wester

11、n blot檢測p-Akt、總Akt、p-eNOS、總eNOS的表達。
　　 LXR激動劑T0901317(2μmol/L)處理EPCs24 h后，RT-PCR檢測EPCs分泌的常見促血管生長因子(VEGF、SDF-1、HGF、IGF-1和G-CSF)mRNA的表達。采用LXR激動劑T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)或GW3965(0、0.5、2、5μmol/L)處理EPCs，不同時間點收取細胞和細胞上清，Rea

12、l-Time PCR、western blot、ELISA檢測VEGF的mRNA、蛋白的表達和分泌。
　　 2.4.統(tǒng)計學處理
　　 所有計量資料以平均值±標準差(-x±s)表示，使用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，組間比較選用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 3.結果
　　 3.1.LXR激動劑對小鼠頸動脈損傷血管內皮修復的影響
　　 LXR激

13、動劑T0901317干預后可明顯增加頸動脈損傷后第4天、7天和14天的再內皮化面積(P<0.05，n=8)，提示激活內源性LXR可以明顯地促進損傷血管內皮的再生和修復。
　　 3.2.LXR對內皮細胞的增殖、遷移能力的影響及機制研究
　　 3.2.1.HUVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 細胞呈單層生長，互不重疊，形態(tài)呈多角形、橢圓形或梭形，呈鋪路石樣鑲嵌排列；激光共聚焦顯微鏡下顯示細胞質vWF陽性(紅色熒光)即

14、為HUVECs，鑒定陽性率>95％(n=6)。
　　 3.2.2.LXR激動劑增強HUVECs增殖、遷移能力
　　 不同濃度的T0901317(0.5、2、5μmol/L)處理后，HUVECs的增殖和遷移能力明顯增強，并與T0901317呈一定的劑量依賴關系(P<0.05，P<0.01，n=4-6)；表明LXR激動劑可以促進HUVECs的增殖和遷移。
　　 3.2.3.LXR激動劑調節(jié)HUVECs增殖、遷移能力的

15、機制研究
　　 3.2.3.1.LXR激動劑對HUVECs中PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響
　　 T0901317處理后，呈時間和劑量依賴的上調HUVECs中p-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177的表達(P<0.05，P<0.01，n=3-5)，PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)可以明顯阻斷上述作用，提示T0901317通過PI3K激活Akt/eNOS信號通路。然而在T09013

16、17干預的早期(<1 h)，未見明顯的p-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177水平上調，提示LXR激活后可能通過間接作用導致了HUVECs中PI3K/Akt/eNOs信號途徑的活化。
　　 3.2.3.2.LXR激動劑通過PI3K/Akt/eNOS途徑增強HUVECs的增殖、遷移能力
　　 采用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預處理HUVE

17、Cs30 min后，T0901317(5μmol/L)促進HUVECs增殖和遷移的效應明顯減弱(P<0.05，P<0.01，n=4-6)，而LY294002和L-NAME并沒有改變HUVECs的細胞活力和基礎遷移水平(P=N.S.，n=4-6)；說明LXR激動劑可以通過PI3K/Akt/eNOS信號途徑增強HUVECs的增殖、遷移能力。
　　 3.3.LXR對內皮祖細胞的生物學功能的影響及機制探討
　　 3.3.1.大鼠

18、BM-EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 成功分離大鼠BM-EPCs，呈梭形、橢圓形或三角形，早期可見典型的克隆單位“集落”形成；晚期呈“線型”、“管型”或者“網狀”血管樣生長趨勢，密度較大時呈鋪路石樣排列。DiI-ac-LDL(紅色)和FITC-UEA-I(綠色)雙染陽性即為正在分化的EPCs，所分離培養(yǎng)的細胞雙染陽性率大于90％。流式細胞技術檢測到CD133、CD34、VEGFR-2和CD31在所培養(yǎng)細胞(5～7天)中的陽性率

19、分別為75.4％、82.3％、64.9％、86.2％和84.6％，符合EPCs的特征。
　　 3.3.2.小鼠Spleen-EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 成功分離小鼠Spleen-EPCs，呈梭形、橢圓形或三角形，早期可見典型的克隆單位“集落”形成；晚期呈“線型”、“管型”或者“網狀”血管樣生長趨勢，密度較大時呈鋪路石樣排列。DiI-ac-LDL(紅色)和FITC-UEA-I(綠色)雙染陽性率大于90％，流式細胞技術

20、檢測到Sca-1、CD34、c-kit、VEGFR-2及CD31在所培養(yǎng)細胞(5～7天)中的陽性率分別為89.2％、75.4％、92.9％和91.9％，符合EPCs的特征。
　　 3.3.3.檢測LXR在EPCs的表達
　　 培養(yǎng)的不同時間點(4天、7天、10天、14天)的大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs中，我們均檢測到LXRα、LXRβ mRNA和蛋白的表達，免疫熒光提示LXRα、LXRβ在EPCs的細胞

21、核和細胞漿均有表達，但主要表達于細胞核中；采用LXR激動劑T0901317或GW3965處理EPCs后，LXR的靶基因ABCA1的轉錄水平均明顯上調，提示LXR在EPCs是具有轉錄活性和生物學功能的。
　　 3.3.4.LXR激動劑增強EPCs的增殖、遷移能力
　　 兩種不同的LXR激動劑T0901317(0.5、2、5μmol/L)或GW3965(0.5、2、5μmol/L)處理后，大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen

22、-EPCs的增殖和遷移能力均明顯增強，并與LXR激動劑呈一定的劑量依賴關系(P<0.05，P<0.01，n=4-6)；表明LXR激動劑可以促進EPCs的增殖和遷移。
　　 3.3.5.LXR激動劑調節(jié)EPCs增殖、遷移能力的機制研究
　　 3.3.5.1.LXR激動劑對EPCs中PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響
　　 LXR激動劑T0901317或GW3965處理后，呈時間和劑量依賴的上調EPCs(大鼠B

23、M-EPCs和小鼠Spleen-EPCs)中-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177的表達(P<0.05，P<0.01，n=3-5)，PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)可以明顯阻斷上述作用，提示激活LXR通過PI3K導致Akt/eNOS信號通路的活化。然而在LXR激動劑干預的早期(<1h)，未見明顯的p-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177水平上調，提示LXR激活后可能通過間接作用導致了EPCs

24、中PI3K/Akt/eNOs信號途徑的活化。
　　 3.3.5.2.LXR激動劑通過PI3k/Akt/eNOS途徑增強EPCs的增殖、遷移能力
　　 采用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預處理EPCs(大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs)30 min后，T0901317(2μmol/L)和GW3965(5μmol/L)促進EPCs增殖和遷移的

25、效應明顯減弱(P<0.05，P<0.01，n=4-6)，而LY294002和L-NAME并沒有改變EPCs的細胞活力和基礎遷移水平(P=N.S.，n=4-6)；說明LXR激動劑可以通過PI3K/Akt/eNOS信號途徑增強EPCs的增殖、遷移能力。
　　 3.3.6.LXR激動劑對EPCs分泌促血管生長因子的影響
　　 3.3.6.1.LXR激動劑對EPCs中促血管生長因子(VEGF、SDF-1、HGF、IGF-1和G-

26、CSF)mRNA表達的影響
　　 LXR激動劑T0901317(2μmol/L)作用EPCs24 h后，VEGF mRNA的表達水平顯著上調(P<0.05，n=4)，而SDF-1、HGF、IGF-1和G-CSF mRNA表達水平未見明顯變化，提示LXR激動劑可以上調EPCs中VEGF mRNA的表達。
　　 3.3.6.2.LXR激動劑對EPCs中VEGF表達和分泌的影響
　　 LXR激動劑T0901317或GW

27、3965作用于EPCs后，呈時間和劑量依賴的上調VEGF mRNA的表達(P<0.05，P<0.01，n=4-6)，呈劑量依賴的上調VEGF蛋白的表達(P<0.05，n=6)和促進VEGF的分泌(P<0.05，P<0.01，n=5)，說明LXR激活后可以上調EPCs中VEGF的表達和促進VEGF的分泌。
　　 4.結論
　　 4.1.LXR激動劑通過PI3K/Akt/eNOS信號途徑增強內皮細胞的增殖和遷移能力；