急性白血病中分泌型卷曲相關(guān)蛋白基因甲基化狀態(tài)對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及Wnt信號(hào)途經(jīng)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)和T-A克隆測(cè)序檢測(cè)九種惡性血液病細(xì)胞株以及急性白血病患者SFRP基因的甲基化狀態(tài)，篩選SFRP基因高甲基化的惡性血液病細(xì)胞株，并將其作為研究SFRP基因甲基化與表達(dá)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；探討5-雜氮-2'脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)逆轉(zhuǎn)急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株SFRP基因甲基化狀態(tài)及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用

2、及其可能的機(jī)制，同時(shí)觀察SFRP基因甲基化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)對(duì)Wnt信號(hào)途徑及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　 方法：采用MSP和T-A克隆測(cè)序檢測(cè)九種惡性血液病細(xì)胞株以及急性白血病患者SFRP基因的甲基化狀態(tài)；采用CCK-8法檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)Jurkat細(xì)胞系存活率的影響；Hoechst-PI熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況，Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；MSP法檢測(cè)藥物作用前后SFRP基因甲基化狀態(tài)變化，熒光

3、實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)SFRP基因、RT-PCR檢測(cè)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B以及β-catenin、survivin、c-myc、和cyclin-D1 mRNA的表達(dá)；Western-blotting鑒定β-catenin蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：(1)經(jīng)過(guò)MSP和T-A克隆測(cè)序鑒定，SFRP1、2、4、5基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在九種惡性血液病細(xì)胞系中廣泛存在；87例AL患者中SFRP1、2、4、5甲基化總陽(yáng)性率

4、分別是35.6％、25.3％、12.6％、17.2％。(2)5-Aza-CdR作用Jurkat細(xì)胞72h后SFRP基因甲基化程度明顯減弱，并且表達(dá)上調(diào)，同時(shí)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)下降并呈濃度依賴(lài)性。(3)5-Aza-CdR對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，隨藥物濃度的增高，細(xì)胞凋亡比例也逐漸增加。(4)5-Aza-CdR作用Jurkat細(xì)胞72h后，Jurkat細(xì)胞中β-catenin表達(dá)明顯降低，

5、同時(shí)survivin、c-myc和cyclin-D1等表達(dá)也隨藥物濃度的增高而降低，與未加藥組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：(1)SFRP1、2、4、5基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在惡性血液病細(xì)胞系中廣泛存在，在AL患者中，SFRP1、2、4、5基因已出現(xiàn)高頻率甲基化。(2)5-Aza-CdR在體外能夠逆轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞中SFRP基因的高甲基化狀態(tài)，從而激活SFRP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。(3)5-Aza-CdR在體外逆轉(zhuǎn)Jurk