MiR-34b在兒童急性白血病中的表達、甲基化調(diào)控及臨床意義的研究.pdf

1、目的：研究miR-34b在兒童急性白血病中的表達及其啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探討其臨床意義。同時檢測miR-34b對細胞增殖是否有影響，進一步了解其生物學(xué)功能。
　　方法：8種白血病細胞株（U937，HL-60，MV4-11，M2R，K562，Raji，CCRF， DAMI），兒童初診急性白血?。ˋL）患兒骨髓標本87例，其中初診急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）患兒55例，初診急性髓系白血?。ˋML)患兒32例，正常對照患兒43

2、例。提取細胞株或其骨髓標本總RNA，并進行引物特異性逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對miR-34b進行檢測，循環(huán)閾值(Ct值)比較法進行miRNA表達定量分析。統(tǒng)計分析白血病細胞株、初診AL、ALL、AML及MLL+各組患兒miR-34b表達是否有差異，并根據(jù)臨床資料進行進一步分析，以探討miR-34b在兒童初診AL、ALL及AML的意義。同時提取細胞株或其骨髓標本DNA，進行重亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

3、，運用甲基化特異性PCR（MSP）檢測miR-34b啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，并通過甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-aza-2-dC）處理HL-60及K562進一步檢測其甲基化狀態(tài)，結(jié)合臨床資料進一步統(tǒng)計分析兒童初診AL、ALL及AML與其甲基化狀態(tài)是否相關(guān)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染hsa-miR-34b mimics到K562細胞，通過流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，CCK-8法檢測細胞增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1、miR-34b在正常對照、白血

4、病細胞株、兒童初診AL、ALL、AML及MLL+各組的相對表達量(`x±s`x)分別為5.22±1.15、0.03±0.03、1.18±0.47、1.65±0.69、0.18±0.06、0.64±0.34，與正常對照組相比，兒童初診ALL組（P<0.05）、白血病細胞株組、初診AL組、AML組及MLL+組（P均<0.01）均有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2、結(jié)合臨床資料（如性別、年齡、免疫分型、染色體、融合基因、潑尼松實驗等）做了進一步分析

5、，發(fā)現(xiàn)miR-34b的相對表達量與兒童初診ALL患兒潑尼松實驗敏感與否相關(guān)（P<0.05）。
　　3、miR-34b啟動子在8種白血病細胞株中均出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，甲基化陽性率為100%，本實驗共檢測50例兒童初診AL患兒，其中31例初診ALL患兒，19例初診AML患兒，其甲基化陽性率分別為64%（32/50）、77.42%（24/31）和42.11%（8/19），同時檢測23例正常對照患兒，無一例出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。
　　4、5-

6、aza-2-dC處理白血病細胞株HL-60及K562后，miR-34b的相對表達量均明顯升高，分別為49.5倍和18.8倍，其甲基化條帶均明顯減弱。
　　5、結(jié)合臨床資料（如性別、年齡、免疫分型、染色體、融合基因、潑尼松實驗等）做了進一步分析，發(fā)現(xiàn)miR-34b的甲基化狀態(tài)與兒童初診AL患兒的免疫分型相關(guān)，淋系與髓系的miR-34b的甲基化狀態(tài)之間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　6、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染hsa-miR-34b m

7、imics到K562細胞后，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為61%，CCK-8法檢測各組細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hsa-miR-34b mimics組48h、72h、96h及120h均出現(xiàn)細胞增殖抑制作用（P均<0.01），其中72h抑制作用最明顯，抑制率達45.7%。
　　結(jié)論：
　　1、miR-34b在白血病細胞株、兒童初診AL、ALL、AML及MLL+各組患兒中表達均明顯減低，提示miR-34b可能作為新的抑癌基因參與兒童初診A

8、L、ALL及AML的形成，同時在MLL基因重排陽性兒童初診AL的發(fā)病中可能起著重要作用，并影響其預(yù)后。
　　2、miR-34b的相對表達量與兒童初診ALL患兒潑尼松實驗敏感與否相關(guān)，提示其是否可以作為判定兒童初診ALL危險度及預(yù)后的指標。
　　3、miR-34b啟動子在白血病細胞株、兒童初診AL、ALL及AML中均出現(xiàn)高度甲基化現(xiàn)象，提示miR-34b在白血病細胞株、兒童初診AL、ALL及AML中均受甲基化機制調(diào)控，可能作為

9、新的抑癌基因發(fā)揮作用。
　　4、5-aza-2-dC處理白血病細胞株HL-60及K562后，miR-34b的相對表達量明顯升高，甲基化條帶明顯減弱，進一步證實miR-34b在白血病細胞株中受甲基化機制調(diào)控。
　　5、miR-34b的甲基化狀態(tài)與兒童初診AL患兒的免疫分型相關(guān)，提示miR-34b啟動子在兒童初診ALL患兒中甲基化頻率高于兒童初診AML患兒，miR-34b在兒童初診ALL及AML中可能作為新的抑癌基因發(fā)揮作用。<