亞臨床甲減患者血漿及LDL氧化脂肪酸液相色譜-質(zhì)譜檢測及臨床意義.pdf

1、亞臨床甲狀腺功能減退癥是指血清促甲狀腺激素(TSH)水平增高，而血清游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)正常的一種病理狀態(tài)。大多數(shù)專家認(rèn)同亞臨床甲減系早期的、輕度的甲狀腺功能減退。根據(jù)血清TSH水平，亞臨床甲減可分為輕度亞臨床甲減（TSH濃度介于4.5～10 mU/L）和重度亞臨床甲減(TSH≥10mU/L)。在一些前瞻性的隊列研究中報道亞臨床甲減與心血管疾病發(fā)病率及死亡率增加密切相關(guān)，這些可能與在亞臨床甲減患者中存在的

2、致動脈粥樣硬化血脂譜有關(guān);有系列報道在亞臨床甲減患者中總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯水平升高，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低。然而，盡管在亞臨床甲減患者中可能存在上述脂質(zhì)異常，但這也許并不能全部解釋亞臨床甲減患者中動脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)病率的增加，可能還有其它致病因素的參與。在亞臨床甲減患者中脂質(zhì)譜的改變往往導(dǎo)致低密度脂蛋白(LDL)氧化易感性的改變;眾所周知，氧化型LDL在動脈粥樣硬化的發(fā)

3、病中有著重要作用。Diekman等報道在甲減患者中由于缺少甲狀腺素(T4)的抗氧化保護(hù)，循環(huán)中的LDL易于發(fā)生過氧化;然而，在亞臨床甲減患者中關(guān)于LDL的氧化易感性改變相關(guān)研究和報道較少。
　　LDL氧化是一系列復(fù)雜的過程，牽涉較多的氧化通路，其中一重要的途徑是通過脂氧合酶(LOX)通路發(fā)生氧化，產(chǎn)生過氧羥基廿碳四烯酸(HPETE)和過氧羥基十八碳二烯酸(HPODE)。這些HPETE和HPODE隨之被還原為對應(yīng)的羥基衍生物羥基廿碳

4、四烯酸(HETE)和羥基十八碳二烯酸(HODE);在LDL中亞油酸(LA)和花生四烯酸(AA)的氧化對應(yīng)著各自形成HODE和HETE。這些HETE和HODE在動脈粥樣硬化的形成中發(fā)揮著重要的作用。現(xiàn)有的脂質(zhì)過氧化研究以針對花生四烯酸居多，關(guān)于亞油酸氧化的研究和報道相對較少，盡管亞油酸為LDL中最主要的多不飽和脂肪酸(PUFA)。除了對LDL的研究外， Rago等用UPLC-MS/MS方法檢測了一組冠心病患者和正常對照血漿中的18個主要類

5、花生酸類產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在冠心病患者血漿中9-HODE、13-HODE、8-HETE和白三烯B4(LTB4)的水平反而較正常對照組明顯降低，可能為心臟病嚴(yán)重程度的負(fù)性標(biāo)志物。目前關(guān)于亞臨床甲減患者LDL或血漿中亞油酸和花生四烯酸氧化應(yīng)激產(chǎn)物——HODE、HETE水平的變化及其與亞臨床甲減病情及動脈粥樣硬化輕重程度的關(guān)系尚未見有文獻(xiàn)報道。
　　目的:
　　考慮到亞臨床甲減可增加動脈粥樣硬化和心血管病的發(fā)病風(fēng)險，并且脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物

6、（主要是HETE和HODE）可能在動脈粥樣硬化的發(fā)病中有著重要的作用，因此本研究擬:
　　1、比較輕、重度亞臨床甲減患者與正常對照組血漿和LDL中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物——HODE和HETE表達(dá)水平的差異，以評價亞臨床甲減患者氧化應(yīng)激狀況;
　　2、探討脂質(zhì)過氧化、TSH水平和亞臨床動脈粥樣硬化指標(biāo)——頸動脈內(nèi)中膜厚度(intima-media thickness，IMT)三者之間的潛在聯(lián)系，了解亞臨床甲減患者動脈粥樣硬化發(fā)病風(fēng)險增

7、加的潛在機(jī)制;
　　3、比較血漿與LDL中HODEs、HETEs表達(dá)水平的差異，了解其在反映動脈硬化程度敏感性和特異性上的差異，力圖尋找一個比IMT更佳的替代標(biāo)志物來反映動脈粥樣硬化。
　　對象:
　　亞臨床甲減的診斷標(biāo)準(zhǔn)基于血清TSH水平高于正常值上限，而血清FT4正常;根據(jù)TSH升高的程度，亞臨床甲減患者進(jìn)一步分為輕度(TSH水平介于4.5～10 mU/L)和重度（TSH≥10 mU/L）。研究對象來自山東省寧陽縣

8、2013年1月至2013年2月流調(diào)人群（n=1331），嚴(yán)格按照既定的入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，有160名患者初步診斷為亞臨床甲減，半年后復(fù)查甲狀腺功能以排除實驗室誤差及TSH的暫時性升高等，有129名患者二次檢測結(jié)果均符合亞臨床甲減的診斷并最終診斷為亞臨床甲減，在這些患者中應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法最終隨機(jī)挑選10例輕度亞臨床甲減患者及10例年齡、性別匹配的重度亞臨床甲減患者;正常對照組選自同一流調(diào)人群，嚴(yán)格按照排除標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)病史詢問、體格檢查、心電圖和

9、常規(guī)實驗室檢查等排除患任何疾病，亦間隔半年重復(fù)測量二次甲狀腺功能均正常后初篩入選200名，采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇10名作為正常對照組，年齡、性別均匹配。
　　方法:
　　1、收集每個研究對象基本臨床資料;超聲測量頸動脈內(nèi)中膜厚度;留取血標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)生化指標(biāo)及甲狀腺功能檢測;留取部分血漿加入抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)后-80℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)的LDL分離及質(zhì)譜檢測;
　　2、快速蛋白液相色譜法(

10、Fast Performance Liquid Chromatograhy，F(xiàn)PLC)分離血漿LDL:先收集FPLC各組分后應(yīng)用血總膽固醇和甘油三酯試劑盒分別測定各組分總膽固醇和甘油三酯濃度，從而鑒定LDL峰所在位置，再定向收集LDL;用試劑盒測定LDL基本參數(shù);
　　3、摸索質(zhì)譜條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將血漿和LDL樣品分別經(jīng)前處理提取脂質(zhì)后應(yīng)用Thermo Vantage三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-ESI-MS)分別檢測血漿及LD

11、L中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物HODE和HETE的含量。
　　統(tǒng)計分析:
　　本實驗采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料均以(X)±s表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較;方差不齊或非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis H檢驗)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行因素間的相關(guān)分析。
　　

12、結(jié)果:
　　1、各組間臨床基線資料的比較
　　重度SCH組LDL-C和mean-IMT水平較正常對照組顯著升高(P＜0.05)，而在輕度SCH組LDL-C和mean-IMT水平與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;三組間年齡、性別、BMI、收縮壓和舒張壓、空腹血糖、TC、HDL-C和甘油三酯水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　在LDL中，TC濃度在正常對照組、輕度SCH及重度SCH組中呈逐步升

13、高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;TG濃度在三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2、TSH水平與mean-IMT的相關(guān)性分析
　　在所有研究對象中，TSH水平與mean-IMT呈顯著正相關(guān)(r=0.401，P=0.028);即使在矯正年齡、性別、TC、 HDL-C，LDL-C和TG后兩者仍呈顯著正相關(guān)（r=0.480，P=0.018），此結(jié)果在一定程度上揭示了亞臨床甲減患者隨著TSH水平升高，動脈粥樣硬

14、化發(fā)病風(fēng)險顯著增加。
　　3、亞臨床甲減患者脂質(zhì)過氧化水平的比較
　　無論是在血漿還是LDL中，重度SCH組9-HODE和13-HODE水平均顯著高于正常對照組(P＜0.05或＜0.01)，而輕度SCH組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);重度SCH組血漿9-HODE水平較輕度SCH組亦顯著升高(P＜0.01)。重度SCH組血漿5-HETE水平較正常對照組顯著升高(P＜0.05)，而輕度SCH組與正常對照組比較

15、差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;血漿12-HETE的濃度，在輕度和重度SCH組均較正常對照組顯著升高（分別P＜0.05和0.01），而重度SCH組與輕度SCH組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同于血漿，在LDL中5-，12-和15-HETE水平在三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、LDL中HODE水平與TSH的相關(guān)性分析
　　Spearman's相關(guān)分析顯示LDL中9-HODE和13-HODE水平均與TSH呈顯著正相關(guān)（分別

16、r=0.376、P=0.041，和r=0.447，P=0.013），提示隨著TSH水平的升高LDL中脂質(zhì)過氧化水平顯著增加。
　　5、血漿與LDL中HODEs及HETEs水平在反映動脈硬化程度上敏感性的比較
　　把研究對象根據(jù)max-IMT水平分為正常組（max-IMT≤0.9mm，n=16）和內(nèi)膜增厚組（max-IMT＞0.9mm，n=14），在內(nèi)膜增厚組LDL中，無論是9-HODE還是13-HODE水平均較正常組顯著升高

17、，P值分別為0.017和0.015。而血漿中9-HODE和13-HODE水平在內(nèi)膜增厚組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)。對5-，12-，和15-HETE水平，無論是在血漿還是LDL中，在內(nèi)膜增厚組與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　LDL中HODE水平與mean-IMT的Spearman's相關(guān)分析提示，LDL中9-HODE和13-HODE水平均與mean-IMT呈顯著正相關(guān)（r值分別為0.47

18、9、0.447，P值分別為0.007、0.013），而HETE水平與mean-IMT不相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、亞臨床甲減患者隨著TSH水平的增加，出現(xiàn)了血脂、脂質(zhì)過氧化水平及動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的顯著增加，驗證了亞臨床甲減、脂質(zhì)過氧化及動脈粥樣硬化之間的密切聯(lián)系;
　　2、血LDL中的9-HODE和13-HODE水平是較HETEs及血漿中相關(guān)指標(biāo)在反映動脈硬化程度上更敏感的指標(biāo);
　　3、本研究提示有必要對重