不同品種豬腸道微生物與體脂、ANGPTL4基因關(guān)系的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、本研究以實(shí)時(shí)熒光定量TagMan-PCR和原代培養(yǎng)豬回腸上皮細(xì)胞技術(shù),研究了不同品種豬腸道微生物與體脂、ANGPTL4基因的關(guān)系。研究包括六個(gè)試驗(yàn)。 試驗(yàn)一豬擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬16SrDNATagMan-PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立 通過對(duì)豬腸道30種細(xì)菌的16SrDNM序列進(jìn)行比對(duì)分析,設(shè)計(jì)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬熒光定量的特異引物;以多形擬桿菌菌株(CDCl404-A)基因組的DNA為模板,用常規(guī)PCR引物擴(kuò)增

2、16SrDNA靶片斷,將PCR產(chǎn)物純化后作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品,按1.19×10<'2>-1.19×10<'6>copies/ul 5個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品作模板,建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線;用TaqMan探針建立25ul反應(yīng)體系,對(duì)不同濃度的多形擬桿菌DNA樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)探針的敏感性;并以乳酸桿菌、大腸桿菌和雙歧桿菌的基因組DNA模板作陰性對(duì)照,檢測(cè)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬的特異性。結(jié)果表明: 1)通過克隆測(cè)序,得到了擬桿菌屬一普雷沃氏菌屬細(xì)菌

3、的16SrDNA部分共有片段序列,該序列與Genbank中發(fā)表的多形擬桿菌(基因序列號(hào)為M58763)和中間普雷沃菌(基因序列號(hào)為AY323522)16SrDNA基因序列相比,該片段為多形擬桿菌的792~1003和中間普雷沃菌的763-974位堿基的片段,同源性分別為92%和94%。 2)25ul PCR反應(yīng)體系中Mg<'2+>的最佳工作濃度均為5.0mM,探針最佳工作濃度為.24μM,Taqman探針敏感性為3.73個(gè)/ul;

4、 3)本試驗(yàn)所制作的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在1.19×10<'2>-1.19×10<'6>copies/ul范圍線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)品可用于后續(xù)試驗(yàn)的研究。 試驗(yàn)二不同品種豬腸道微生物與體脂的關(guān)系試驗(yàn) 通過選用在同一條件下飼養(yǎng)的0、1、2、3、4和5月齡的長(zhǎng)白和太湖豬各4頭,屠宰取后回腸和盲腸內(nèi)容物,檢測(cè)1、3和5月齡長(zhǎng)白和太湖豬回腸和盲腸內(nèi)容物的總細(xì)菌、革藍(lán)氏陽(yáng)性細(xì)菌(Grampositivebacteria,G’)、革藍(lán)

5、氏陰性細(xì)菌(Gramnegativebacteria,G<'->)、革藍(lán)氏陽(yáng)性細(xì)菌/革藍(lán)氏陰性細(xì)菌(G<'+>/G<'->)、擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬(Bacteroides-Prevotella,B.P)細(xì)菌數(shù)量、背膘厚度、脂肪率、脂肪細(xì)胞直徑和肌內(nèi)脂肪。結(jié)果表明: 1)太湖豬的回腸和盲腸內(nèi)容物的G<'->及B.P細(xì)菌數(shù)量在不同年齡階段均顯著(p(O.05)高于長(zhǎng)白豬,G<'+>/G<'->極顯著低于(p(0.01)長(zhǎng)白豬,總細(xì)

6、菌、G<'->與長(zhǎng)白豬無顯著差異(p>O.05)。 2)豬回腸和盲腸的B.P和G<'->數(shù)量都與背膘厚度、脂肪率、脂肪細(xì)胞直徑和肌內(nèi)脂肪都有正相關(guān)關(guān)系,而G<'+>/G<'->比例與背膘厚度、脂肪率、脂肪細(xì)胞直徑和肌內(nèi)脂肪有負(fù)相關(guān)關(guān)系。 試驗(yàn)三豬 ANGPTL4基因的克隆及其實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR檢測(cè)方法的建立 為了對(duì)ANGPTL4基因進(jìn)行更為準(zhǔn)確定量,本研究首先克隆長(zhǎng)白和太湖豬的ANGPTL4和β-a

7、ctin的DNA序列。根據(jù)所測(cè)定的序列,分別設(shè)計(jì)引物和探針,以回腸基因組的cDNA為模板,用常規(guī)PCR引物擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物純化作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品,ANGPTL4和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品分別按1.37×10<'4>-1.37×10<'9>和8.31×10<'5>-8.31×10<'10>copies/mL的稀釋梯度建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,以TaqMan探針建立25ul反應(yīng)體系,優(yōu)化探針的最佳工作濃度,并檢測(cè)探針的靈敏度。結(jié)果表明: 1

8、)應(yīng)用克隆測(cè)序方法獲得了長(zhǎng)白和太湖豬的目的基因ANGPTL4和內(nèi)參基因β-actin的部分序列,所獲得的長(zhǎng)白和太湖豬的ANGPTL4的片斷與參照序列(AY751522)的同源性分別為98%和92%,而β-actin與參照序列(U07786)的同源性都為98%。 2)ANGPTL4和β-actin探針在25ul體系中的最佳工作濃度分別為0.35州和0.40μM,探針的靈敏度分別為13.7和83.1拷貝/u1; 3)所構(gòu)建的

9、ANGPTL4和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線良好,反應(yīng)體系中分別含有1.37×10><'4>-1.37×10<'9>和8.31×10<'5>-8.31×10<'10>copies/mL時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,所得標(biāo)準(zhǔn)品可以用于后續(xù)試驗(yàn)。 試驗(yàn)四ANGPTL4基因在豬不同組織器官中的表達(dá)差異試驗(yàn) 通過選用在同一條件下飼養(yǎng)的4月齡長(zhǎng)白和太湖豬各4頭,屠宰后取肝臟、脂肪、心臟、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸。根據(jù)試驗(yàn)三

10、克隆的長(zhǎng)白和太湖豬的ANGPTL4基因的序列,采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)~GPTI。4在不同品種組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明: 1)豬ANGPTI。4基因在肝臟、脂肪、心臟、小腸和大腸四種組織中都有表達(dá),其中在脂肪組織的表達(dá)最豐富,其次是肝臟、大腸、心臟、小腸。 2)太湖豬的脂肪和肝臟組織ANGPTL4基因相對(duì)表達(dá)量都極顯著(p<0.01)高于長(zhǎng)白豬,回腸和空腸中ANGPTL4基因表達(dá)量極顯著低于(p<0.01)長(zhǎng)白豬

11、,盲腸、結(jié)腸、心臟中ANGPTL4基因表達(dá)量與長(zhǎng)白豬無差異(p>0.05)。 試驗(yàn)五不同品種豬回腸微生物與ANGPTL4基因的關(guān)系 選擇0日齡健康正常的太湖豬和長(zhǎng)白豬各24頭進(jìn)行150天的試驗(yàn)。每個(gè)品種設(shè)為一個(gè)處理,每個(gè)處理按體重一致原則設(shè)4個(gè)重復(fù),公母各半,每個(gè)重復(fù)6頭豬。在同一環(huán)境條件下飼予相同的飼糧,分別在0、1、2、3、4、5月齡,每種豬各屠宰4頭,測(cè)定回腸中ANGPTL4基因表達(dá)量和擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬細(xì)菌數(shù)

12、量。結(jié)果表明: 1)1-5月齡的太湖豬回腸擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬數(shù)量均高于長(zhǎng)白豬,特別是在2、3和5月齡,極顯著(p<0.01)高于長(zhǎng)白豬。兩品種豬的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬數(shù)量,都是隨著年齡增加,呈現(xiàn)先增加,2月齡下降,然后再上升的規(guī)律。 2)1-5月齡太湖豬回腸ANGPTL4基因表達(dá)量均低于長(zhǎng)白豬,特別是在1、2和5月齡極顯著(p<0.01)低于長(zhǎng)白豬,但在0日齡與長(zhǎng)白豬的差異不顯著(p>0.05):兩品種豬ANGPT

13、L4基因表達(dá)量與擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬的變化成相反趨勢(shì),即先下降,后增加,再下降。 3)豬回腸擬桿菌、G<'->數(shù)量都與回腸ANGPTL4基因表達(dá)存在顯著(p<0.01)的負(fù)相關(guān)關(guān)系,而G<'+>/G<'->比例與回腸ANGPTL4基因表達(dá)存在極顯著(p<0.01)的正相關(guān)關(guān)系。 試驗(yàn)六多形擬桿菌及代謝產(chǎn)物對(duì)豬回腸上皮細(xì)胞ANGPTL4表達(dá)的影響 本試驗(yàn)以原代培養(yǎng)豬回腸上皮細(xì)胞為研究模型,研究了多形擬桿菌及其代謝

14、產(chǎn)物對(duì)豬回腸上皮細(xì)胞ANGPTL4表達(dá)的影響。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理,多形擬桿菌-1(10<'8>Cfu/ml),多形擬桿菌-2(10<'7>Cfu/ml)、多形擬桿菌-3(10<'6>Cfu/ml)、代謝產(chǎn)物-1(10<'8>稀釋度)、代謝產(chǎn)物-2(10<'7>稀釋度)、代謝產(chǎn)物-3(10<'6>稀釋度)及對(duì)照組。10<'8>Cfu/ml多形擬桿菌和其相應(yīng)代謝產(chǎn)物組都設(shè)20個(gè)重復(fù),其它處理組設(shè)4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1孔,在37℃培養(yǎng)96h后分別換

15、為含多形擬桿菌10<'8>、10<'4>、O<'6>Cfu/mlDMEM培養(yǎng)液和相應(yīng)的代謝產(chǎn)物,分別于1、3、7、12和26小時(shí)收集10<'8>Cfu/m多形擬桿菌和其相應(yīng)代謝產(chǎn)物處理組的細(xì)胞,觀察隨濃度和作用細(xì)胞時(shí)間的變化,多形擬桿菌和其代謝產(chǎn)物影響ANGPTL4基因的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明: 1)多形擬桿菌與腸細(xì)胞數(shù)目為1:1時(shí),即可抑制回腸ANGPTL4基因表達(dá),這種抑制作用隨多形擬桿菌的濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)越明顯。

16、 2)多形擬桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不影響ANGPTL4基因表達(dá),但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),ANGPTL4基因表達(dá)有提高的趨勢(shì)(p>0.05)。 綜合上面六個(gè)試驗(yàn),可得出如下結(jié)論: 1)太湖豬回腸和盲腸內(nèi)容物G<'->及B.P的數(shù)量高于長(zhǎng)白豬,而G<'+>/G<'->低于長(zhǎng)白豬,總細(xì)菌數(shù)及G<'+>與長(zhǎng)白豬的差異不顯著;隨年齡的增加,總細(xì)菌數(shù)、G<'+>、G<'->的數(shù)量有增加的趨勢(shì),G<'+>/G<'->有下降的趨勢(shì),B.P的數(shù)

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