C-EBP-α基因誘導(dǎo)肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞凋亡差異的體內(nèi)外研究及乙?；{(diào)控探討.pdf

1、肝纖維化及其終末期疾病肝硬化目前仍是困擾全球的健康問題。它可以由多種疾病引起，最終可導(dǎo)致肝功能衰竭和門靜脈高壓，目前尚無有效治療方法，終末期多需要肝臟移植。因此，了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)其預(yù)防和治療十分重要。
　　 目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。靜止?fàn)顟B(tài)下HSCs為一種儲(chǔ)存維生素A和脂類的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，可以維持正常情況下肝臟的基底膜基質(zhì)平衡。肝臟損傷可以誘導(dǎo)

2、HSCs激活，使其失去儲(chǔ)存脂類的特征，增生并合成富含Ⅰ型膠原纖維的纖維基質(zhì)。激活的HSCs還可以釋放炎癥因子和多種致纖維化的細(xì)胞因子，以及組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)，改變細(xì)胞外基質(zhì)平衡，促進(jìn)膠原纖維沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化。
　　 長(zhǎng)久以來一直認(rèn)為肝纖維化是不可逆轉(zhuǎn)的，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，其中心環(huán)節(jié)是激活的HSCs發(fā)生凋亡

3、。因此，如何促使激活的HSCs發(fā)生凋亡成為防治肝纖維化的重要目標(biāo)。
　　 目前認(rèn)為HSCs的分化類似于脂肪細(xì)胞。因而一些特異性調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的基因也可能調(diào)控HSCs的分化。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancerbinding protein，C/EBP)在脂肪分化中起到重要作用。尤其是C/EBP-α可以調(diào)控前脂肪細(xì)胞的成熟和分化。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)C/EBP-α可以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)HSCs發(fā)生凋亡。但是C

4、/EBP-α對(duì)肝細(xì)胞有何作用，以及其對(duì)肝細(xì)胞和HSCs的作用有無差異仍知之甚少。因此，我們采用表達(dá)C/EBP-α的腺病毒載體(Ad-C/EBP-α)在體內(nèi)和體外檢測(cè)C/EBP-α誘導(dǎo)肝細(xì)胞和HSCs凋亡的差異。此外，我們進(jìn)一步研究了HSCs中C/EBP-α是否受乙?；{(diào)控，旨在了解乙酰化調(diào)控機(jī)制在C/EBP-α誘導(dǎo)HSCs凋亡中的作用，以期進(jìn)一步了解肝纖維化的發(fā)病機(jī)制。
　　 第一部分腺病毒介導(dǎo)的C/EBP-α基因誘導(dǎo)肝細(xì)胞和H

5、SCs凋亡差異的體外研究
　　 目的:檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)的C/EBP-α基因誘導(dǎo)肝細(xì)胞和HSCs凋亡有無差異。
　　 方法:構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的C/EBP-α基因Ad-C/EBP-α，分別用50，100，200MOIAd-C/EBP-α感染大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A和HSCs細(xì)胞系HSC-T6，48小時(shí)后采用DNA ladder電泳、流式細(xì)胞儀、AnnexinV/PI染色檢測(cè)兩種細(xì)胞凋亡有無差異，以及Western Blot方法檢

6、測(cè)分析各種Caspases包括Caspase3，8，9，12的表達(dá)情況，探討C/EBP-α誘導(dǎo)兩種細(xì)胞的凋亡途徑有無差異。
　　 結(jié)果：HSCs和肝細(xì)胞對(duì)C/EBP-α誘導(dǎo)的凋亡有顯著差異。DNA ladder結(jié)果顯示HSCs從50MOI開始就產(chǎn)生DNA ladder現(xiàn)象，而肝細(xì)胞直到200MOI也沒有發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞分析和AnnexinV/PI染色結(jié)果顯示HSCs從50MOI時(shí)就發(fā)生顯著凋亡，并呈劑量依賴性增高。而肝細(xì)胞無明

7、顯變化。Western Blot法結(jié)果顯示Ad-C/EBP-α感染后，50MOI時(shí)可以引起HSCs發(fā)生凋亡，而200MOI時(shí)才會(huì)引起肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。Caspase9參與了兩種細(xì)胞的凋亡途徑，而Caspase8，12未參與Ad-C/EBP-α誘導(dǎo)的兩種細(xì)胞的凋亡途徑。Caspase9抑制劑可以顯著抑制HSCs的凋亡，但僅部分抑制肝細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)論：Ad-C/EBP-α誘導(dǎo)肝細(xì)胞和HSCs發(fā)生凋亡在劑量上有顯著差異，但都是與

8、線粒體途徑有關(guān)。
　　 第二部分腺病毒介導(dǎo)的C/EBP-α基因誘導(dǎo)肝細(xì)胞和HSCs凋亡差異的體內(nèi)研究
　　 目的:檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)的C/EBP-α基因?qū)Cl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的作用。
　　 方法:采用腹腔注射CCl4建立Balb/c小鼠的肝纖維化模型。從造模第1周(早期預(yù)防組)或第6周(晚期治療組)通過尾靜脈注射Ad-C/EBP-α，10周后處死動(dòng)物。采用免疫組織化學(xué)方法和Western Blot檢測(cè)C/EBP

9、-α在肝臟內(nèi)的表達(dá)。透射電鏡觀察血竇內(nèi)皮結(jié)構(gòu)。眼球采血檢測(cè)小鼠血清白蛋白、總蛋白、ALT、γ-GT的表達(dá)。常規(guī)HE染色和天狼猩紅染色以及肝組織羥脯氨酸含量測(cè)定來檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組肝纖維化的程度；采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織α-SMA、PCNA表達(dá)變化。TUNEL法柃測(cè)肝細(xì)胞和HSCs的凋亡情況。
　　 結(jié)果:尾靜脈注射Ad-C/EBP-α后小鼠肝臟石蠟切片中C/EBP-α表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，且主要位于HSCs內(nèi)；透射電鏡可見肝竇內(nèi)

10、皮窗孔逐漸消失，內(nèi)皮下連續(xù)性基底膜形成，治療后好轉(zhuǎn)。常規(guī)HE染色、天狼猩紅染色和肝組織羥脯氨酸含量測(cè)定證實(shí)無論是預(yù)防組還是治療組，膠原纖維含量均顯著低于對(duì)照組；血清學(xué)指標(biāo)顯示注射Ad-C/EBP-α后，γ-GT表達(dá)量顯著下降，其他指標(biāo)各組之間無明顯差異。免疫組織化學(xué)染色顯示Ad-C/EBP-α注射組肝組織內(nèi)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)顯著減少，TUNEL檢測(cè)顯示凋亡的主要是HSCs。
　　 結(jié)論:體內(nèi)感染Ad-C/EBP-α基因能有

11、效緩解CCh誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，大大減少肝纖維化模型肝組織內(nèi)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并且促進(jìn)HSCs的凋亡，而對(duì)肝細(xì)胞無明顯促凋亡作用，對(duì)肝臟功能亦無明顯損傷。
　　 第三部分 C/EBP-α基因誘導(dǎo)大鼠HSCs凋亡的乙?；{(diào)控的探討
　　 目的:研究乙?；瘜?duì)C/EBP-α誘導(dǎo)HSCs凋亡的作用有無影響，以及其可能的機(jī)制。
　　 方法:選取不同HDACI包括TSA，SAHA以及尼克酰胺，采用不同劑量對(duì)大鼠肝細(xì)胞

12、系BRL-3A和HSCs系HSC-T6進(jìn)行處理，用CCK-8法檢測(cè)其對(duì)肝細(xì)胞和HSCs生長(zhǎng)抑制率的影響；Western Blot檢測(cè)不同劑量的TSA聯(lián)合Ad-C/EBP-α同時(shí)處理HSC-T6后Caspase3，8，9，12表達(dá)情況，Realtime RT-PCR以及WesternBlot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TSA對(duì)HSC-T6內(nèi)源性C/EBP-α mRNA和蛋白的表達(dá)影響，以及組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)TIP60表達(dá)的差異。應(yīng)用免疫共沉

13、淀方法檢測(cè)C/EBP-α的乙酰化水平以及C/EBP-α和TIP60有無相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1)TSA，SAHA和尼克酰胺三種HDACI中TSA對(duì)。HSCs的增生抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肝細(xì)胞，而SAHA和尼克酰胺則相反。
　　 2)TSA本身可以誘導(dǎo)HSCs發(fā)生凋亡，并可以增強(qiáng)C/EBP-α誘導(dǎo)HSCs的凋亡作用。
　　 3)HSC-T6經(jīng)TSA處理后，乙?；皆龈?，C/EBP-α mRNA表達(dá)量不