頭頸部鱗狀細胞癌中表皮生長因子受體的表達、單核苷酸多態(tài)性及基因表達調控的初步研究.pdf

1、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）指發(fā)生于口腔、咽、喉、鼻腔、鼻竇、唾液腺、頸段氣管及食管的鱗狀細胞癌，其組織來源于上呼吸消化道的粘膜上皮細胞。2003年統(tǒng)計SCCHN每年在世界范圍內大約有540，000例新發(fā)病例，其中可造成271，000例死亡病例，死亡率超過50％。由于SCCHN具有局部浸潤生長、易原位復發(fā)及遠處轉移的特點，目前其治療仍然是一個富有挑戰(zhàn)性的臨床課題，其發(fā)病率及死亡率較高。雖然外科手術、放射治療及輔助化療等治療方法的綜合應

2、用在一定程度上提高SCCHN患者生存率，但大部分研究表明其晚期患者5年生存率仍僅在30％和40％之間。因此研究SCCHN發(fā)生過程中的分子生物學機制，對于SCCHN的早期診斷以及為SCCHN的治療提供新靶點具有重要意義。表皮生長因子受體（EGFR）是一種分子量為170 kDa的糖蛋白，其編碼基因位于染色體7p12，包含28個外顯子，屬于ErbB受體家族。EGFR的活化可以抑制細胞凋亡，促進細胞增殖和血管形成。其異?；罨蓪е录毎惓Ｔ鲋臣?/p>

3、其他促進腫瘤增長的反應，并可增加腫瘤細胞惡性轉移的潛能。研究表明在多種上皮源性腫瘤包括SCCHN中均存在EGFR的表達異常，其中大部分表現(xiàn)為EGFR的過表達，其表達可能與SCCHN的預后密切相關，因此EGFR基因被視為可能的SCCHN治療的新靶點。因此，研究SCCHN中EGFR基因表達、關鍵外顯子的突變或單核苷酸多態(tài)性與臨床病理指標間的關系，并進一步分析其基因表達調控機制，有助于深入理解SCCHN發(fā)生的分子機制，對于SCCHN的分子靶向

4、治療有指導意義。本研①利用PCR技術檢測了中國SCCHN患者新鮮組織標本中EGFR的表達改變，分析了EGFR表達與臨床病理指標及預后的關系；②通過PCR及直接測序的方法證實在中國SCCHN患者中存在EGFR外顯子的單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象，并分析了其與臨床病理指標及預后的關系；③克隆了人EGFR基因上游2875 bp的啟動調控區(qū)片段，利用瞬時轉染、報道基因分析、缺失突變分析、RT-PCR、Western blot等方法研究了該區(qū)域的啟動子活性，

5、并對該區(qū)域的順式作用元件進行了初步分析。 1.[研究目的]研究頭頸部鱗狀細胞癌患者腫瘤組織中EGFR表達改變及其與臨床病理指標及預后的關系。 [研究方法] ①收集96例原發(fā)SCCHN腫瘤組織，并收集距腫瘤切緣1 cm以上部位的形態(tài)學正常的粘膜組織作為對照。 ②TRIzol法分別提取腫瘤組織和正常粘膜組織中的總RNA，反轉錄成cDNA。根據(jù)EGFR基因組序列合成EGFR特異性引物，以5S RNA為內參照，通

6、過PCR檢測腫瘤組織和正常粘膜組織中EGFR表達水平的差異。 ③應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析?？ǚ浇y(tǒng)計分析EGFR表達與臨床病理指標間的關系，非參數(shù)統(tǒng)計應用于不適用卡方統(tǒng)計者；Kaplan-Meier生存率分析及Cox回歸模型繪制生存率曲線并分析預后，無病生存期的計算采取自診斷之日起至明確證明發(fā)生局部復發(fā)、遠處轉移或死亡的時間。所有的統(tǒng)計分析均為雙側，取P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 [結果] ①在

7、96例SCCHN臨床標本中，74例（77.1％）腫瘤組織對比其臨近的形態(tài)學正常的組織出現(xiàn)EGFR表達異常；其中47例（49.0％）過表達，27例（28.1％）低表達。 ②EGFR表達與性別、腫瘤大小（T分期）、頸部淋巴結轉移（N分期）及飲酒無關；與年齡、腫瘤的原發(fā)部位、組織分化程度、臨床分期及吸煙有關。 ③EGFR的過表達主要發(fā)生于年齡小于60歲的吸煙者、原發(fā)于口咽或喉咽部的腫瘤、中低分化的腫瘤及臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的SCC

8、HN患者。 ④生存率分析表明EGFR表達與SCCHN的預后無關，目前數(shù)據(jù)并不支持其作為SCCHN患者獨立的預后因素。 [結論] ①在SCCHN患者腫瘤組織中存在EGFR的表達異常。 ②過表達EGFR的SCCHN多原發(fā)于喉咽及口咽部。 ③吸煙可能引起EGFR的表達增加。 ④EGFR是SCCHN發(fā)生及發(fā)展過程中的重要影響因子，起到了癌蛋白的作用； 2.[研究目的]研究中國頭頸部鱗狀細胞

9、癌患者EGFR基因第18～21號外顯子中是否存在突變或單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象，并進一步研究及其與臨床病理指標及預后的關系。 [研究方法] ①收集96例原發(fā)SCCHN腫瘤組織，并收集距腫瘤切緣1cm以上部位的形態(tài)學正常的粘膜組織作為對照。 ②提取腫瘤組織及正常粘膜組織中的基因組DNA。根據(jù)EGFR基因第18、19、20、21號外顯子序列分別設計引物，進行PCR擴增，凝膠電泳回收上述四條外顯子目的帶，雙向測序，檢測其是否存

10、在基因突變或單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象。 ③應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。兩樣本率的比較采用u檢驗；卡方統(tǒng)計分析測序結果臨床病理指標間的關系，非參數(shù)統(tǒng)計應用于不適用卡方統(tǒng)計者；Kaplan-Meier生存率分析及Cox回歸模型繪制生存率曲線并分析預后，無病生存期的計算采取自診斷之日起至明確證明發(fā)生局部復發(fā)、遠處轉移或死亡的時間。 [結果] ①對EGFR基因18～21號外顯子的DNA測序表明，在中國SCCHN

11、患者中EGFR基因18～21號外顯子未發(fā)現(xiàn)明顯突變；22例（22.9％）患者的20號外顯子存在單核苷酸多態(tài)性（SNP），其第78號位點的鳥嘌呤（G）被腺嘌呤（A）取代。密碼由CAG變?yōu)镃AA，相應的氨基酸（谷氨酰胺）并沒有改變。這表明這是一個同義的單核甘酸多態(tài)（sSNP）。 ②上述22例患者EGFR基因20號外顯子單核苷酸多態(tài)均為G/A雜合。 ③中國SCCHN患者中EGFR基因20號外顯子G/A雜合sSNP出現(xiàn)率與Gen

12、eBank正常亞洲人的數(shù)據(jù)之間有統(tǒng)計學差異。 ④G/A雜合sSNP與組織分化程度、局部淋巴結轉移無關，而與原發(fā)部位、T分期及臨床分期有關。 ⑤G/A雜合sSNP主要存在于T1～2、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期及原發(fā)于喉咽的SCCHN中。 ⑥該sSNP與EGFR的表達無明顯相關性。 ⑦生存率分析表明G/A雜合患者與G/G純合患者的生存期差異無統(tǒng)計學意義，目前的數(shù)據(jù)不能支持該sSNP為SCCNH獨立的預后因素。

13、[結論] ①中國SCCHN患者中EGFR基因18～21號外顯子發(fā)生突變的概率較低。 ②中國SCCHN患者中EGFR基因20號外顯子第78號位點G/A雜合sSNP的發(fā)生率高于健康人群。 ③EGFR基因20號外顯子第78位的sSNP可能成為一個有效的預測SCCHN，尤其是喉咽部鱗狀細胞癌臨床過程的指標。 ④EGFR基因20號外顯子第78位的sSNP與EGFR的表達無關。 ⑤目前的數(shù)據(jù)并不支持且EGFR

14、基因20號外顯子sSNP是中國SCCHN患者無病生存率的獨立的預后因素。 3.[研究目的]克隆人EGFR基因5’上游2875 bp的啟動調控區(qū)片段，對該區(qū)域可能存在的功能性順式作用元件進行初步分析。 [研究方法] ①提取人基因組DNA，PCR擴增EGFR基因5’上游2875 bp（-2644～+231bp）啟動調控區(qū)序列，插入pGL3-Basic，構建EGFR基因啟動調控區(qū).熒光素酶報道基因表達載體pGL3-EG

15、FR-2875，酶切鑒定和測序分析證實插入片段是否正確。 ②pGL3-EGFR-2875瞬時轉染喉癌細胞株Hep-2，熒光素酶報道基因分析檢測啟動子活性。 ③將C/EBPα等蛋白因子表達載體與pGL3-EGFR-2875共轉染Hep-2細胞，報道基因分析觀察C/EBPα等蛋白因子對啟動子活性的影響。 ④應用RT-PCR和Western blot技術驗證C/EBPα等蛋白因子的作用。 ⑤在pGL3-EGFR

16、-2875基礎上構建了3個較大范圍的5’缺失突變體，與C/EBPα表達載體共轉染Hep-2細胞，報道基因分析觀察缺失突變對啟動子活性的影響，并分析C/EBPα表達載體可能的作用區(qū)域。 [結果] ①構建了較大范圍的EGFR基因5’上游啟動調控區(qū)重組質粒pGL3-EGFR-2875，酶切鑒定及DNA測序結果正確。 ②pGL3-EGFR-2875在Hep-2細胞呈現(xiàn)很強的啟動子活性。 ③共轉染實驗結果顯示C/E

17、BPα的表達載體明顯抑制EGFR啟動子活性，RT-PCR和Western blot進一步證實C/EBPα對EGFR表達的抑制作用。 ④pGL3-EGFR-2875的缺失突變分析顯示，C/EBPα表達載體的作用區(qū)域可能位于-618～+231 bp內。 ⑤-1619～-871 bp區(qū)域的缺失可導致啟動子活性下降72％，說明該區(qū)域可能存在功能性正調控元件。 [結論] ①正確克隆了人EGFR基因上游2875 bp