頭頸鱗狀細胞癌中NiR-21的表達及常見microRNA單核甘酸多態(tài)性的初步研究.pdf

1、頭頸鱗狀細胞癌（HeadandNeckSquamousCellCarcinoma,HNSCC）是一類發(fā)生于口腔、口咽部、喉咽部及喉部的鱗狀細胞癌，其組織來源上呼吸消化道的粘膜上皮細胞。頭頸鱗狀細胞癌在世界范圍內(nèi)是第5大常見惡性腫瘤。吸煙飲酒被認為是頭頸腫瘤最重要的危險因子。除煙酒外，人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染可能是另外一種重要的病因因子。盡管近些年來，目前包括手術(shù)，放療及化療的綜合治療被運用以改

2、善HNSCC的無病生存率，但進展期的HNSCC患者的5年生存率僅僅徘徊在30％左右。因此，很有必要進一步了解HNSCC的生物機制并識別預(yù)測分子標記物，這將有助于對疾病的早期診斷，個體化治療及引導(dǎo)新的治療方案的發(fā)展和評估。在過去的幾十年里，腫瘤研究者主要集中在對蛋白編碼基因的研究，包括癌基因和抑癌基因。但最近，作為非編碼RNA基因產(chǎn)物microRNA已經(jīng)引起了研究者的重視。
　　 MicroRNAs是一種內(nèi)源性的遺傳上高度保守的大

3、約22個堿基長度的單鏈非編碼小分子RNA分子。通過與其靶點信使RNA的3’-端非編碼區(qū)的堿基完全配對或者不完全配對結(jié)合，導(dǎo)致目的信使RNA的切除或者轉(zhuǎn)錄抑制，從而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。MicroRNAs作為一類新發(fā)現(xiàn)基因調(diào)節(jié)因子，在廣泛的生理病理活動中扮演著重要的角色，例如細胞增生、分化、凋亡、免疫/炎癥應(yīng)答系統(tǒng)、應(yīng)急耐受和代謝等。盡管microRNA準確的生物作用機制依然未被完全揭示，但大量研究已經(jīng)證實microRNAs可能作為腫瘤癌

4、基因或抑癌基因通過影響細胞的生長發(fā)展參與人類腫瘤的形成，同時microRNA表達的改變與HNSCC等很多腫瘤病因?qū)W，診斷、發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。
　　 MiR-21是癌癥研究中最常見的microRNAs之一，它在很多實體腫瘤中表達上調(diào)。例如乳腺癌、肺癌、胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌、膽管癌和胰腺內(nèi)分泌腫瘤等。MiR-21高表達在頭頸腫瘤中也被觀察到。因為microRNA表達具有組織特異性，因此它的表達情況能潛在地暗示HNSCC亞

5、型之間的生物學通路/機制的不同。磷酸酶張力蛋白同源物(Phosphataseandtensinhomologue，PTEN)在腫瘤的形成過程中扮演著重要角色，同時PTEN表達降低與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、腫瘤的TNM分期及微血管密度密切相關(guān)。一些研究報道顯示PTEN參與調(diào)節(jié)腫瘤的放療敏感性及化療敏感性。更重要的是，最近有研究顯示PTEN在肝癌細胞株及一些腫瘤組織中可能是MiR-21的一種靶基因。但在喉鱗狀細胞癌(LaryngealSq

6、uamousCellCarcinoma,LSCC)和喉咽鱗狀細胞癌(HypopharyngealSquamousCellCarcinoma,HSCC)中MiR-21的表達與PTEN表達之間的關(guān)系尚未報道。在本研究研究中，我們首次研究了在LSCC和HSCC中MiR-21和PTEN的表達以及他們之間關(guān)系，從而使我們更進一步了解MiR-21在LSCC和HSCC形成及發(fā)展過程中的作用。
　　 研究證實HPV感染是HNSCC一個重要的發(fā)病

7、因子，尤其是在口-口咽鱗狀細胞癌(OralSquamousCellCarcinoma,OSCC)中。更重要的是，在對感染的固定免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中，MicroRNAs參與調(diào)節(jié)免疫/炎癥應(yīng)答系統(tǒng)及凋亡通路。值得注意的是，免疫/炎癥應(yīng)答系統(tǒng)及凋亡通路在HPV的清除及免疫逃逸過程中伴有重要角色。因此，microRNAs的某種基因改變可能影響HPV狀態(tài)和對OSCC的易感性。
　　 在microRNAs分子內(nèi)部或者他們的鏈接位點

8、上當單核甘酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)可能對pri-microRNA模板的轉(zhuǎn)錄過程，microRNA前體加工成熟microRNA的過程或microRNA與其靶點基因的相互作用過程產(chǎn)生影響。據(jù)我們所知，在microRNA分子內(nèi)部及與其相結(jié)合的靶點基因上的一些microRNA單核苷酸多態(tài)性對microRNA的功能和他們的靶點基因的表達產(chǎn)生重要的影響，從而導(dǎo)致腫瘤易感性。最近的研究已經(jīng)研究了包括

9、miR146rs2910164,miR149rs2292832，miR196rs11614913，andmiR499rs3746444在內(nèi)的一些microRNASNPs同HNSCC發(fā)病風險之間的關(guān)系?？紤]到HPV在OSCC發(fā)生過程中的作用，我們研究血清HPV16狀態(tài)和這四種常見microRNASNPs的共同作用對OSCC發(fā)病風險的影響。
　　 第一部分，MiR-21和PTEN在喉及喉咽鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義
　　

10、試驗?zāi)康?
　　 研究MiR-21和PTEN在喉及喉咽鱗狀細胞癌中的表達，并分析它們的表達情況同患者臨床特征之間的關(guān)系以及它們的表達情況兩者之間的關(guān)系。
　　 試驗方法:
　　 1.收集60例原發(fā)性HNSCC腫瘤組織（30例LSCC和30例HSCC），并收集距離腫瘤切緣2cm以上的形態(tài)學正常的臨近正常粘膜作為對照。
　　 2.TRIzol法分別提取腫瘤組織和正常粘膜組織中的富含小RNA的總RNA。

11、　　 3.用TaqmanmicroRNA試劑盒及ABI7900HTSequenceDetectionPCR儀器通過Real-timeRT-PCR方法檢測MiR-21在腫瘤組織和臨近正常粘膜組織中的表達情況。
　　 4.免疫組織化學染色被用于檢測PTEN在60例腫瘤組織和60例臨近正常粘膜組織中的表達情況。
　　 5.統(tǒng)計分析用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件。MiR-21的相對表達用均數(shù)（mean）±標準差(SD)表示。在腫

12、瘤組織中和臨近正常粘膜之間的MiR-21和PTEN的不同表達分別用配對t檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗。兩組樣本間的比較分別采用獨立樣本t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。多組間的比較采用單向方差分析或Kruskall-Wallis檢驗。所有統(tǒng)計分析均為雙側(cè)，當P＜0.05時，認為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.在LSCC和HSCC腫瘤組織中MiR-21的表達水平明顯高于非腫瘤組織(P＜0.05)。上調(diào)

13、表達的MiR-21同臨床分期(P=0.001)，腫瘤大小(P=0.007)，病理特征(P=0.025)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)相關(guān)。
　　 2.在LSCC和HSCC腫瘤組織中PTEN的免疫組化染色明顯弱于其臨近的正常粘膜組織(P＜0.05)，其下調(diào)表達的PTEN同腫瘤分期(P=0.025)，腫瘤大小(P=0.017)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.040)相關(guān)。
　　 3.在LSCC和HSCC腫瘤組織中的MiR-21的表達與

14、PTEN的表達成負性相關(guān)。
　　 實驗結(jié)論:
　　 1.MiR-21可能在LSCC和HSCC的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要的角色。
　　 2.PTEN在LSCC和HSCC中表達下調(diào)。
　　 3.在LSCC和HSCC腫瘤組織中的MiR-21的表達與PTEN的表達成負性相關(guān)。
　　 第二部分，MicroRNA單核苷酸多態(tài)性增加HPV16相關(guān)的口咽鱗狀細胞癌的發(fā)病風險
　　 實驗?zāi)康?
　　

15、 證實microRNA單核甘酸多態(tài)性可能改變血清HPV16狀態(tài)同OSCC發(fā)病風險之間的關(guān)系的假說。
　　 實驗方法:
　　 1.按照頻率配對原則，325例原發(fā)OSCC的非西班牙裔白人患者及335例非癌癥正常對照被招募。所有研究參與候選人簽訂知情同意書并完成一份關(guān)于人口資料及包括吸煙飲酒狀態(tài)在內(nèi)的腫瘤危險因子的流行病問卷調(diào)查表。
　　 2.通過標準的ELISA檢測研究參與者的血清HPV16的狀態(tài)。
　　 3

16、.血液DNA提取試劑盒從3ml全血中提取基因組DNA。
　　 4.應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction-restrictionfragment-lengthpolymorphism，PCR-RFLP)擴增包括miR146rs2910164,miR149rs2292832,miR196rs11614913,andmiR499rs3746444.的多態(tài)性在內(nèi)的片段。
　　 5.

17、用卡方檢驗對選定的人口變量、吸煙、飲酒、microRNA基因頻率及血清HPV16不同狀態(tài)在病例組合對照組之間的分布差異進行評估。用單因素和多因素logistic回歸分析計算其比值比（Oddsratios，ORs）和95％的置信區(qū)間(Confidenceinterval,CIs)來評估血清HPV16狀態(tài)和microRNA基因型對OSCC發(fā)病風險的影響。我們也評估血清HPV16狀態(tài)和microRNA的基因型對OSCC發(fā)病風險的聯(lián)合作用，同時

18、根據(jù)煙酒狀態(tài)及腫瘤位點對這種作用進行分層分析。應(yīng)用SAS9.1進行所有的統(tǒng)計分析。所有統(tǒng)計分析均為雙側(cè)，當P＜0.05時，認為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.在OSCC患者中的血清HPV16陽性比對照組中常見。
　　 2.總體上，沒有發(fā)現(xiàn)這四種常見microRNA多態(tài)性同OSCC發(fā)病風險之間存在有統(tǒng)計意義的關(guān)系。
　　 3.同攜帶miR499rs3746444TT基因型同時血清HPV16陰性的

19、個體相比，我們發(fā)現(xiàn)攜帶miR499rs3746444CT或CC基因型同時血清HPV16陰性的個體的OSCC發(fā)病風險增高（OR=1.4，95％CI=1.0-2.0），我們發(fā)現(xiàn)攜帶miR499rs3746444TT基因型同時血清HPV16陽性的個體的OSCC發(fā)病風險增高（OR=3.4，95％CI=2.0-5.6），攜帶miR499rs3746444CT或CC基因型同時血清HPV16陽性的個體明顯增加OSCC發(fā)病風險(OR=4.1，95％CI

20、=2.1-8.0)。類似的結(jié)果對于miR146rs2910164，miR149rs2292832和miR196rs11614913的多態(tài)性也存在。
　　 4.按照吸煙飲酒狀態(tài)進行進一步的分層分析，我們發(fā)現(xiàn)我們研究的每種microRNA多態(tài)性改變HPV16感染相關(guān)的OSCC的發(fā)病風險，同時這種改變作用在從不吸煙人群中尤其明細;同口腔鱗狀細胞癌(OralCavitySquamousCellCarcinoma,OCSCC)相比，口咽部