茶園土壤假單胞菌咖啡因降解相關(guān)基因克隆及功能解析.pdf

1、微生物或體外酶發(fā)酵途徑降解咖啡因是今后茶產(chǎn)品脫咖啡因的重要研究方向之一。本文以高耐咖啡因的假單胞菌菌株CT25為研究對(duì)象，在優(yōu)化基因組文庫構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了插入片段長度5-8kb的CT25基因組文庫，經(jīng)抗咖啡因篩選和測(cè)序獲得了與降解咖啡因相關(guān)的基因簇，并采用細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究了咖啡因氮源對(duì)CT25基因表達(dá)的影響。主要結(jié)果如下:
　　采用不完全酶切法構(gòu)建基因組文庫時(shí)，可將2μg基因組DNA以0.2-0.4USau3AI在37℃

2、下酶切5min，產(chǎn)物電泳后分段回收不同分子量的DNA片段，并與線性化和去磷酸化處理后的載體分別進(jìn)行連接，再經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，可獲得較好的文庫構(gòu)建效果。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，采用shear儀剪切基因組DNA，經(jīng)末端補(bǔ)平、連接載體和電轉(zhuǎn)化，也可獲得令人滿意的建庫效果。
　　從構(gòu)建的基因組文庫（庫容約1.5萬、插入序列約5-8kb）中隨機(jī)選取1000個(gè)克隆進(jìn)行了咖啡因降解篩選實(shí)驗(yàn)，獲得了7個(gè)能降解咖啡因的陽性轉(zhuǎn)化子，分別為CTG-

3、004、CTG-005、A1、A13、F17、O3、P16。經(jīng)測(cè)序和生物信息學(xué)分析顯示，CTG-004上的類frataxin鐵硫簇蛋白和鐵硫氧化還原酶，CTG-005上的HAMP域蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白，A1上的N代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)蛋白，A13上的BAND7家族蛋白,F17上的葉酸代謝相關(guān)蛋白Fic/DOC，O3上的自由基SAM蛋白/鉬輔因子生物合成蛋白以及P16上的雙能半胱氨酸脫硫酶/硒代半胱氨酸裂解酶SufS和Fe-S簇代謝蛋白Suf

4、E等基因可能與轉(zhuǎn)化子降解咖啡因能力提升有關(guān)。說明CT25高耐咖啡因能力是由位于不同基因簇的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和氧化降解多個(gè)功能基因簇共同協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。
　　比較了以咖啡因或蛋白胨為唯一氮源/碳源的CT25細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組差異，結(jié)果顯示，在含咖啡因培養(yǎng)基中，CT25細(xì)菌通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)感應(yīng)環(huán)境N和C源變化，降低多數(shù)轉(zhuǎn)錄活化因子和調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)活性，進(jìn)而使大量與DNA復(fù)制和修復(fù)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、蛋白合成、tRNA加工以及脂肪代謝等相關(guān)