移植腎慢性排斥反應外周血miRNA表達譜篩查與靶基因預測.pdf

1、腎移植是治療尿毒癥的最佳手段，移植術(shù)后排斥反應的發(fā)生往往不可避免。隨著移植配型技術(shù)的進步以及新型免疫抑制劑的開發(fā)使用，腎移植術(shù)后急性排斥反應的發(fā)生率顯著下降，但慢性排斥反應仍然嚴重威脅著移植腎的長期存活。移植腎穿刺活檢是診斷慢性排斥反應的金標準，但穿刺活檢屬于有創(chuàng)檢查，存在一定的并發(fā)癥，增加受者的心理及生理負擔。常規(guī)生化檢驗與影像學檢查無法確定是否存在慢性排斥反應，所以，臨床上迫切需要尋找一種無創(chuàng)的、高敏感性、高特異性的生物學指標,能夠

2、實現(xiàn)慢性排斥反應的無創(chuàng)診斷。
　　微小RNA(microRNA、miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的功能。miRNA在人體生長發(fā)育、細胞凋亡等各種病理生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，人體內(nèi)miRNA表達量的改變與各種生理和病理狀態(tài)密切相關(guān)，比較不同狀態(tài)下miRNA表達譜可以發(fā)現(xiàn)特征性表達的miRNA，這既是優(yōu)良的疾病標志物，還可用作疾病的防治靶標及機制研究的切入點。
　　目的:
　　1、比較移植腎

3、慢性排斥反應與術(shù)后穩(wěn)定恢復受者外周血miRNA表達譜的不同，篩選出特征性表達的miRNA，為實現(xiàn)慢性排斥反應的無創(chuàng)診斷提供參考;2、預測特征性表達miRNA所調(diào)控的靶基因，為后續(xù)移植腎慢性排斥反應相關(guān)機制研究提供基礎。
　　方法:
　　選擇3例經(jīng)移植腎穿刺病理明確診斷為“T細胞介導的慢性排斥反應”的受者為實驗組，3例腎移植術(shù)后移植腎穿刺病理診斷無異常的受者為對照組。抽取兩組受者外周靜脈血，提取血液RNA，進行純度及完整性檢測

4、、poly(A)加尾、Flash Tag Biotin HSRLigation標記、Affymetrix-miRNA芯片雜交，掃描儀掃描芯片結(jié)果，進行芯片數(shù)據(jù)分析，比較兩組miRNA表達譜差異，篩選出特征性表達的miRNA，運用TaqMan探針的方法進行實時定量熒光聚合酶鏈反應(qRT-PCR)驗證芯片結(jié)果。采用mirecords數(shù)據(jù)庫檢索差異表達的miRNA調(diào)控的靶基因，初步分析靶基因分布特征。
　　結(jié)果:
　　1、兩組血

5、液樣本總RNA濃度均大于34.9ng/ml，在260nm/280nm的吸收峰值均介于1.8-2.1;甲醛變性凝膠電泳結(jié)果顯示兩組樣本均出現(xiàn)兩條粗亮而濃的條帶，最上面一條28S和下面一條18S，且28S條帶的亮度幾乎為18S的兩倍。表明抽提的RNA純度及完整性較好，質(zhì)量檢測合格，未出現(xiàn)明顯降解及污染等跡象。
　　2、miRNA表達譜芯片結(jié)果:Affymetrix-miRNA芯片總共檢測了6658種miRNA在兩組之間的表達差異情況，

6、結(jié)果顯示34種miRNA表達存在顯著差異(p＜0.05);其中12種表達上調(diào),miR-4423-3p上調(diào)最明顯（7.09倍），上調(diào)表達的miRNA多定位于1號和2號染色體;22種miRNA表達下調(diào)，miR-3613-5p下調(diào)最明顯（0.08倍），下調(diào)表達的miRNA多定位于9號和14號染色體。
　　3、實時熒光定量PCR結(jié)果:選取miR-4423-3p和miR-133a-3p進行實時熒光定量PCR驗證，結(jié)果顯示miR-133a-3

7、p及miR-4423-3p表達差異倍數(shù)與芯片結(jié)果吻合，說明芯片檢測結(jié)果可靠。
　　4、靶基因查詢顯示差異表達的34種miRNA共調(diào)控約9003種靶基因表達，這些靶基因部分分布在炎癥反應、血管再生、淋巴細胞活化、細胞增殖等方面。
　　結(jié)論:
　　腎移植慢性排斥反應受者外周血miRNA表達譜存在特征性改變，這些特征性miRNA所調(diào)控的靶基因與炎癥、淋巴細胞活化、血管再生、纖維化等過程有關(guān)。這可能為臨床尋找診斷慢性排斥反應的