瘤胃異常代謝產物組胺對奶牛肝臟中COX-2表達的影響.pdf

1、隨著規(guī)模化、集約化飼養(yǎng)方式的普及，現代牧業(yè)中高產奶牛疾病的疾病增多明顯，嚴重危害奶牛業(yè)健康發(fā)展，而奶牛亞急性瘤胃酸中毒（SARA）是高產奶牛的常見疾病，每年造成巨大損失。奶牛亞急性瘤胃酸中毒時，瘤胃內產生的大量組胺是導致奶牛產生各種炎癥的重要因素。炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α及NF-κB信號通路與炎癥的產生密切相關。為研究奶牛瘤胃酸中毒時血液內組胺濃度的變化及對奶牛炎性因子及炎性信號通路的影響，本試驗通過對健康奶牛飼喂高精料

2、日糧，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒，促使瘤胃內大量產生組胺，手術安裝血管瘺管采集門靜脈和肝靜脈血液樣品，通過檢測血液中組胺含量及COX-2含量，并通過RT-PCR對在體肝臟中的COX-2、NF-κB、IL-6、TNF-α表達水平進行相對定量和絕對定量檢測，為組胺對奶牛炎性信號通路產生的影響提供一定的依據。
　　1.不同日糧精粗比對奶牛組胺和COX-2產生的影響
　　隨機選取6頭泌乳期的成年健康奶牛，隨機分組，采用2×2的拉丁方設計，

3、對兩組奶牛分別飼喂等能等氮的高精料日糧和低精料日糧，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒，手術安裝血管瘺管采集門靜脈和肝靜脈血液樣品，組胺Elisa試劑盒檢測血液中組胺含量，牛COX-2 Elisa試劑盒檢測血液中COX-2的含量。結果表明，高精料組奶牛門靜脈內組胺濃度較對照組均有所增加，高精料組組胺平均濃度（19.99±0.21 ug/L）較低精料組（18.12±0.35ug/L）差異顯著(P＜0.05)，而高精料組血液中平均COX-2濃度（38.3

4、6±0.32ng/ml）較低精料組（12.45±0.41ng/ml）也有顯著提升(p＜0.05)
　　2.不同日糧精粗比下組胺差異對COX-2、NF-κB、IL-6、TNF-α基因表達的影響
　　為了解不同日糧狀況下奶牛體內組胺含量變化對肝臟內COX-2、NF-κB、IL-6和TNF-α基因表達的影響，從分子水平研究奶牛肝臟對組胺反應的作用機理，本試驗通過實時熒光相對定量PCR(RT-PCR)技術檢測了高精料日糧狀況下奶牛肝

5、臟內COX-2、NF-κB、IL-6核TNF-α基因mRNA的表達變化，并分析了其與高精料時組胺濃度變化的關系。結果顯示，高精料組NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α的表達較低精料組均有升高，且NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α四個基因的表達有顯著升高(p＜0.05)。本試驗證明了奶牛SARA中血液內組胺濃度的升高可誘導肝臟對其轉化和降解的效率增加，且組胺含量的增高可誘導奶牛肝臟中NF-KB信號通路的打開，進而導致CO

6、X-2等炎性基因表達。
　　3.不同日糧精粗比下COX-2表達的絕對定量檢測
　　通過穿刺分別采取高精料組奶牛和低精料組奶牛的肝臟樣品，提取總RNA并進行反轉錄，PCR反應后使用DNA凝膠回收試劑盒對DNA進行回收，得到的目的DNA連接19T-vector，之后轉入感受態(tài)細胞DH5α進行大量培養(yǎng)。培養(yǎng)的菌液DNA測序后證實目的DNA成功導入后，使用試劑盒提取質粒，以質粒DNA為標準品分別稀釋10、102、103、104、10