RNAi沉默COX-2對HSC細(xì)胞動力學(xué)及脂質(zhì)代謝的影響.pdf

1、第一章 COX-2基因shRNA干擾載體的構(gòu)建及抗肝纖維化作用
　　目的:
　　構(gòu)建COX-2shRNA真核表達(dá)載體，并觀察其抗肝纖維化作用。
　　方法:
　　1.分別從TRC shRNA、origene shRNA數(shù)據(jù)庫中選取1條大鼠COX2基因及2條人COX2基因序列，分別構(gòu)建3個COX-2ShRNA真核表達(dá)載體，進(jìn)行酶切鑒定和測序；
　　2.脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HSC-T6細(xì)胞株,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)

2、染效率,RT-PCR檢測COX-2mRNA表達(dá), Western-Blot檢測COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)；
　　3.SD大鼠尾靜脈注射腺病毒介導(dǎo)的重組質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染；12周末,處死大鼠；RT-PCR檢測肝組織COX-2mRNA表達(dá),免疫組織化學(xué)檢測肝組織COX-2蛋白質(zhì)表達(dá), HE、MASSON染色分析纖維病變程度,圖像分析儀測量肝組織纖維病變面積。
　　結(jié)果:
　　1.酶切、測序、比對顯示，COX2-shRNA-1,2,3序

3、列成功插入目的載體，且序列完全正確；
　　2.熒光顯微鏡觀察顯示COX-2 shRNA1、COX-2 shRNA2、COX-2 shRNA3轉(zhuǎn)染效率均在70％以上；
　　3.RT-PCR和Western-Blot檢測證實(shí),轉(zhuǎn)染后COX-2shRNA1,2,3均可抑制HSC-T6細(xì)胞株COX-2基因的表達(dá),但抑制程度不一,其中COX-2shRNA-1組抑制作用最明顯；
　　4. COX-2shRNA-1SD大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染,

4、 RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測證實(shí), COX-2shRNA1可抑制COX-2基因表達(dá)及纖維化組織增生。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建 COX-2基因shRNA干擾載體；
　　2. COX-2shRNA1，2，3具有抑制 HSC-T6細(xì)胞 COX-2表達(dá)作用，其中COX-2shRNA-1抑制作用最為明顯；
　　3. COX-2shRNA1具有抑制SD大鼠肝組織COX-2表達(dá)的作用；
　　4. COX-2 s

5、hRNA1具有抑制SD大鼠肝纖維化作用。
　　第二章 RNAi沉默COX-2對HSC基因表達(dá)譜的影響
　　目的: 研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細(xì)胞COX-2后，HSC基因表達(dá)譜的變化。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分為COX-2shRNA1組、HK組（空載體組）；
　　2.Trizol法提取HSC中的總 RNA。純化mRNA,兩組mRNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光標(biāo)記的cDNA混合物探針；
　　3.熒光標(biāo)

6、記的cDNA混合物探針，與27K Rat Genome Array雜交，經(jīng)嚴(yán)格洗片后，用GenePix40OOB掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，計算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到二者間基因表達(dá)的差異信息。
　　結(jié)果:
　　1.按Ratio值≥1.5和≤0.667標(biāo)準(zhǔn),沉默COX-248小時、72小時后，HSC分別有45個和93個基因出現(xiàn)差異性表達(dá)；
　　2.按Ratio值≥2.0和≤0.5標(biāo)準(zhǔn),沉默COX-24

7、8小時、72小時后，HSC分別有12個和23個基因出現(xiàn)差異性表達(dá)；
　　3.沉默COX-2后, HSC-T6差異表達(dá)基因主要與生物學(xué)過程（48小時、72小時分別為54.32%,44.29%）、分子功能（48小時、72小時分別為32.10%，37.14%）有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1. COX-2shRNA1沉默COX-2后HSC基因表達(dá)譜發(fā)生變化；
　　2. COX-2shRNA1沉默COX-2后差異表達(dá)基因主要與

8、生物學(xué)過程、分子功能有關(guān)。
　　第三章 RNAi沉默COX-2對HSC細(xì)胞動力學(xué)及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的: 研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細(xì)胞COX-2后，肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的變化,驗(yàn)證基因芯片篩選的與細(xì)胞動力學(xué)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。
　　方法:
　　1.MTT法檢測細(xì)胞體外增殖活力；
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC-T6凋亡及細(xì)胞周期；
　　3.RT-PCR法和Western

9、 blot法驗(yàn)證細(xì)胞動力學(xué)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。
　　結(jié)果:
　　1.與空白對照組（NC）和空載體（HK）組相比，轉(zhuǎn)染pYr-1.1-hU6-EGFP-COX2-shRNA1質(zhì)粒，48h細(xì)胞凋亡率明顯增加( P<0.01)；
　　2.72h后HSC-T6細(xì)胞的增殖出現(xiàn)明顯的抑制作用(P<0.05)；
　　3. COX-2shRNA1組G1%相較NC組和HK組的G1%增高；；
　　4.RT-PCR驗(yàn)證顯示C

10、dc27、Sh3kbp1表達(dá)增加, Plcd4表達(dá)減弱,其余統(tǒng)學(xué)處理沒有顯著意義。
　　結(jié)論:
　　1.COX-2shRNA1能夠抑制HSC-T6細(xì)胞體外增殖；
　　2.COX-2shRNA1能夠促進(jìn)HSC-T6凋亡；
　　3.COX2ShRNA1可能在G0/G1期阻滯細(xì)胞周期；
　　4. RT-PCR驗(yàn)證顯示Cdc27、Sh3kbp1表達(dá)增加, Plcd4表達(dá)減弱。
　　第四章 RNAi沉默COX-

11、2對HSC脂肪代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的: 研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細(xì)胞COX-2后，肝星狀細(xì)胞脂肪代謝的變化,驗(yàn)證基因芯片篩選的與脂代謝密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。
　　方法:
　　1.高效液相色譜法（HPLC）檢測24小時、48小時、72小時各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、膽固醇、維生素A含量；
　　2.RT-PCR檢查驗(yàn)證脂代謝差異表達(dá)基因。
　　結(jié)果:
　　1.COX-2ShRNA1組細(xì)胞

12、內(nèi)甘油三酯的含量隨著時間的延長逐漸增加（F=34.524,P=0.000）,各時間段的空載體組與空白對照組比較，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量存在顯著差異（均P<0.05）；
　　2.COX-2ShRNA1組細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量隨著時間的延長逐漸降低（F=360.808,P=0.000）,與各時間段的空載體組與空白對照組比較，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量存在顯著差異（均P<0.05）；
　　3.COX-2ShRNA1組細(xì)胞內(nèi)維生素 A的含量隨著時間的

13、延長逐漸增加（F=19346.057,P=0.000）,各時間段的空載體組與空白對照組比較，細(xì)胞內(nèi)維生素A含量存在顯著差異（均P<0.05）；
　　4. RT-PCR驗(yàn)證顯示Acsl6，Apol9a表達(dá)增加。
　　結(jié)論:
　　1.RNAi沉默COX-2，HSC-T6細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、膽固醇、維生素A含量發(fā)生變化，其中甘油三酯、維生素A增加，膽固醇降低；
　　2.RNAi沉默COX-2，Acsl6，Apol9a表達(dá)增