RNAi沉默COX-2對HSC細胞動力學及脂質代謝的影響.pdf

1、第一章 COX-2基因shRNA干擾載體的構建及抗肝纖維化作用
　　目的:
　　構建COX-2shRNA真核表達載體，并觀察其抗肝纖維化作用。
　　方法:
　　1.分別從TRC shRNA、origene shRNA數(shù)據(jù)庫中選取1條大鼠COX2基因及2條人COX2基因序列，分別構建3個COX-2ShRNA真核表達載體，進行酶切鑒定和測序；
　　2.脂質體介導重組質粒轉染 HSC-T6細胞株,熒光顯微鏡觀察轉

2、染效率,RT-PCR檢測COX-2mRNA表達, Western-Blot檢測COX-2蛋白質表達；
　　3.SD大鼠尾靜脈注射腺病毒介導的重組質粒體內轉染；12周末,處死大鼠；RT-PCR檢測肝組織COX-2mRNA表達,免疫組織化學檢測肝組織COX-2蛋白質表達, HE、MASSON染色分析纖維病變程度,圖像分析儀測量肝組織纖維病變面積。
　　結果:
　　1.酶切、測序、比對顯示，COX2-shRNA-1,2,3序

3、列成功插入目的載體，且序列完全正確；
　　2.熒光顯微鏡觀察顯示COX-2 shRNA1、COX-2 shRNA2、COX-2 shRNA3轉染效率均在70％以上；
　　3.RT-PCR和Western-Blot檢測證實,轉染后COX-2shRNA1,2,3均可抑制HSC-T6細胞株COX-2基因的表達,但抑制程度不一,其中COX-2shRNA-1組抑制作用最明顯；
　　4. COX-2shRNA-1SD大鼠體內轉染,

4、 RT-PCR和免疫組織化學檢測證實, COX-2shRNA1可抑制COX-2基因表達及纖維化組織增生。
　　結論:
　　1.成功構建 COX-2基因shRNA干擾載體；
　　2. COX-2shRNA1，2，3具有抑制 HSC-T6細胞 COX-2表達作用，其中COX-2shRNA-1抑制作用最為明顯；
　　3. COX-2shRNA1具有抑制SD大鼠肝組織COX-2表達的作用；
　　4. COX-2 s

5、hRNA1具有抑制SD大鼠肝纖維化作用。
　　第二章 RNAi沉默COX-2對HSC基因表達譜的影響
　　目的: 研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細胞COX-2后，HSC基因表達譜的變化。
　　方法:
　　1.實驗分為COX-2shRNA1組、HK組（空載體組）；
　　2.Trizol法提取HSC中的總 RNA。純化mRNA,兩組mRNA分別逆轉錄合成熒光標記的cDNA混合物探針；
　　3.熒光標

6、記的cDNA混合物探針，與27K Rat Genome Array雜交，經嚴格洗片后，用GenePix40OOB掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，計算機軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進行比較，得到二者間基因表達的差異信息。
　　結果:
　　1.按Ratio值≥1.5和≤0.667標準,沉默COX-248小時、72小時后，HSC分別有45個和93個基因出現(xiàn)差異性表達；
　　2.按Ratio值≥2.0和≤0.5標準,沉默COX-24

7、8小時、72小時后，HSC分別有12個和23個基因出現(xiàn)差異性表達；
　　3.沉默COX-2后, HSC-T6差異表達基因主要與生物學過程（48小時、72小時分別為54.32%,44.29%）、分子功能（48小時、72小時分別為32.10%，37.14%）有關。
　　結論:
　　1. COX-2shRNA1沉默COX-2后HSC基因表達譜發(fā)生變化；
　　2. COX-2shRNA1沉默COX-2后差異表達基因主要與

8、生物學過程、分子功能有關。
　　第三章 RNAi沉默COX-2對HSC細胞動力學及相關基因表達的影響
　　目的: 研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細胞COX-2后，肝星狀細胞增殖、凋亡及細胞周期的變化,驗證基因芯片篩選的與細胞動力學密切相關的差異表達基因。
　　方法:
　　1.MTT法檢測細胞體外增殖活力；
　　2.流式細胞術檢測HSC-T6凋亡及細胞周期；
　　3.RT-PCR法和Western

9、 blot法驗證細胞動力學密切相關的差異表達基因。
　　結果:
　　1.與空白對照組（NC）和空載體（HK）組相比，轉染pYr-1.1-hU6-EGFP-COX2-shRNA1質粒，48h細胞凋亡率明顯增加( P<0.01)；
　　2.72h后HSC-T6細胞的增殖出現(xiàn)明顯的抑制作用(P<0.05)；
　　3. COX-2shRNA1組G1%相較NC組和HK組的G1%增高；；
　　4.RT-PCR驗證顯示C

10、dc27、Sh3kbp1表達增加, Plcd4表達減弱,其余統(tǒng)學處理沒有顯著意義。
　　結論:
　　1.COX-2shRNA1能夠抑制HSC-T6細胞體外增殖；
　　2.COX-2shRNA1能夠促進HSC-T6凋亡；
　　3.COX2ShRNA1可能在G0/G1期阻滯細胞周期；
　　4. RT-PCR驗證顯示Cdc27、Sh3kbp1表達增加, Plcd4表達減弱。
　　第四章 RNAi沉默COX-

11、2對HSC脂肪代謝及相關基因表達的影響
　　目的: 研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細胞COX-2后，肝星狀細胞脂肪代謝的變化,驗證基因芯片篩選的與脂代謝密切相關的差異表達基因。
　　方法:
　　1.高效液相色譜法（HPLC）檢測24小時、48小時、72小時各組細胞內甘油三酯、膽固醇、維生素A含量；
　　2.RT-PCR檢查驗證脂代謝差異表達基因。
　　結果:
　　1.COX-2ShRNA1組細胞

12、內甘油三酯的含量隨著時間的延長逐漸增加（F=34.524,P=0.000）,各時間段的空載體組與空白對照組比較，細胞內甘油三酯含量存在顯著差異（均P<0.05）；
　　2.COX-2ShRNA1組細胞內膽固醇的含量隨著時間的延長逐漸降低（F=360.808,P=0.000）,與各時間段的空載體組與空白對照組比較，細胞內膽固醇含量存在顯著差異（均P<0.05）；
　　3.COX-2ShRNA1組細胞內維生素 A的含量隨著時間的

13、延長逐漸增加（F=19346.057,P=0.000）,各時間段的空載體組與空白對照組比較，細胞內維生素A含量存在顯著差異（均P<0.05）；
　　4. RT-PCR驗證顯示Acsl6，Apol9a表達增加。
　　結論:
　　1.RNAi沉默COX-2，HSC-T6細胞內甘油三酯、膽固醇、維生素A含量發(fā)生變化，其中甘油三酯、維生素A增加，膽固醇降低；
　　2.RNAi沉默COX-2，Acsl6，Apol9a表達增