RNAi沉默hTERT對HeLa細胞生長的影響.pdf

1、端粒酶在惡性腫瘤、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，深入理解它們之間的關系，及端粒酶在這些病理過程中作用的具體機制，必將給腫瘤及心血管疾病的治療帶來巨大的變化。hTERT介導的細胞轉化、增殖是近年來端粒酶研究的熱點。 hTERT是端粒酶全酶的蛋白組分，在端粒延伸中以逆轉錄酶活性催化合成端粒重復序列，在正常組織不表達，在腫瘤組織及某些活躍增殖的細胞高表達。傳統(tǒng)觀點認為端粒酶通過維持端粒的長度而參與細胞衰老和永生化生物學過程的調

2、節(jié)，近年來的研究揭示，在正常細胞過表達hTERT能促使細胞增殖和轉化，這種作用與端粒延伸無關，甚至不需要端粒酶RNA亞基的參與，提出hTERT可能具有其它的非端粒延伸的功能。 通過近年來的研究，hTERT的促細胞增殖作用已經(jīng)明確，但其中的機制尚未闡明；另一方面，若在腫瘤細胞沉默該基因，是否會出現(xiàn)有利于腫瘤治療的效應?本研究的目的在于探討hTERT的沉默對腫瘤細胞增殖的影響及可能機制。具體地說，用RNAi技術沉默HeLa細胞hTE

3、RT的表達，以觀察在腫瘤細胞這種多個癌基因、抑癌基因突變，多條信號通路和代謝特征改變的背景下，單純下調hTERT的表達，能否使細胞的生長速度明顯放慢，使腫瘤細胞的基因表達譜發(fā)生顯著改變，能否增加細胞對某些化療藥的敏感性，探討端粒酶催化亞單位hTERT促細胞增殖作用的機制，及是否適合作為腫瘤治療的靶點。 第一部分 shRNA表達體的構建和沉默細胞株的篩選方法： 1．以HeLa細胞提取的基因組DNA為模板經(jīng)PCR得到U6啟動

4、子； 2．在質粒pUC119的MCS內插入U6啟動子成為RNAi載體； 3．在RNAi載體U6啟動子的下游插入干擾序列獲得shRNA-hTERT表達體； 4．將兩個shRNA-hTERT表達體和RNAi載體分別與pEGFP-C1共轉染HeLa細胞，G418篩選。 結果： 1．測序顯示構建RNAi載體和表達體正確； 2．篩選得到兩個hTERT沉默的HeLa細胞株和一個對照細胞株。 第

5、二部分 hTERT的沉默對HeLa細胞生長及化療敏感性的影響方法： 1．RT-PCR和Western-Blot檢測hTERT和c-myc的表達水平； 2．細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線； 3．倒置顯微鏡下觀察長春新堿、紫杉醇、順鉑等化療藥對干擾組和對照組細胞的影響，流式測細胞死亡率； 4．細胞免疫化學顯示微管組織狀態(tài)在各組細胞有無差別。探討各組細胞對長春新堿和紫杉醇敏感性差別的原因，hTERT可能具有的新的功

6、能是否與微管組織的調節(jié)有關。 結果： 1．干擾的靶基因hTERT被完全沉默； 2． c-myc的表達在干擾組和對照組細胞無顯著差異； 3．篩選得到的第六代干擾組和對照組細胞生長速度無顯著差異； 4．紫杉醇處理的干擾組細胞死亡率高于對照組； 5．干擾組和對照組細胞經(jīng)紫杉醇處理后的微管分布沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。 結論： 1．成功構建了一個RNAi載體及兩個shRNA表達體。