MT-hTR表達(dá)體的構(gòu)建及其對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、端粒酶是一種核糖核蛋白體(RNP)，RNA和蛋白質(zhì)對(duì)其活性都是必需的，并且端粒酶利用內(nèi)部的RNA模板指導(dǎo)端粒重復(fù)序列合成的機(jī)制是保守的?，F(xiàn)在的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為端粒酶可能通過(guò)維持端粒功能和(或)其它未知的方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。人類腫瘤細(xì)胞中廣泛的存在較高的端粒酶活性，而在人類正常體細(xì)胞中并未檢測(cè)到或儀有微弱的端粒酶活性，這種端粒酶活性分布極大的差異也使其成為當(dāng)今腫瘤治療中的一個(gè)熱門(mén)靶點(diǎn)。 早期的研究發(fā)現(xiàn)在四膜蟲(chóng)、酵母及人的永生化細(xì)胞中引

2、入帶突變模板的端粒酶RNA亞基后會(huì)使得端粒末端的重復(fù)序列發(fā)生改變，而突變端粒酶活性的存在對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是有害的。迄今為止，有個(gè)別報(bào)道在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中引入帶突變模板的人端粒酶RNA亞基(MT-hTR)后，細(xì)胞生長(zhǎng)很快受到抑制，并且這種抑制效應(yīng)的發(fā)生不依賴端粒長(zhǎng)度的改變，也不依賴細(xì)胞最初的端粒長(zhǎng)度或野生型p53的存在。MT-hTR在腫瘤治療中的應(yīng)用前景及其效應(yīng)機(jī)制都有待繼續(xù)探討。 本研究旨在建立能夠在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮指導(dǎo)突變端粒重

3、復(fù)序列合成作用的MT-hTR真核表達(dá)重組體，并初步觀察MT-hTR對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 第一部分:MT-hTR表達(dá)體的構(gòu)建 方法： 1、獲得用于人端粒酶RNA亞基(hTR)真核表達(dá)的合適載體。 2、以HeLa細(xì)胞基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到野生型人端粒酶RNA亞基(WT-hTR)的編碼基因。 3、將WT-hTR的編碼基因插入表達(dá)載體Ul啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建WT-hTR的真核表

4、達(dá)重組體。 4、以WT-hTR表達(dá)體為模板設(shè)計(jì)誘變引物，通過(guò)：PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變得到四種帶突變模板的人端粒酶RNA亞基(MT-hTR)的編碼基因。 5、通過(guò)分子克隆的方法，構(gòu)建四個(gè)MT-hTR的真核表達(dá)重組體。 結(jié)果： 1、測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的WT-hTR表達(dá)體的序列無(wú)誤。 2、測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的四個(gè)MT-hTR表達(dá)體的序列均符合預(yù)期設(shè)計(jì)。 第二部分：MT-hTR表達(dá)細(xì)胞的建立及分析 方法

5、： 1、將空載體、WT-hTR表達(dá)體及MT-hTR表達(dá)體分別與質(zhì)粒pEGFP-C1通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，通過(guò)藥物G418的篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞。 2、提取各組細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞中目的基因hTR的表達(dá)水平。 3、提取各組細(xì)胞的裂解物，用TRAP的方法檢測(cè)細(xì)胞中端粒酶的活性。 4、MTT法繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 5、MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)

6、胞對(duì)藥物柔紅霉素(DNR)的敏感性。 結(jié)果： 1、在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到由重組體表達(dá)的WT-hTR或MT-hTR，成功獲得對(duì)照組細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)WT-hTR或MT-hTR的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。 2、各組細(xì)胞都具有較高的野生型端粒酶活性，并在MT1組細(xì)胞中檢測(cè)到突變型端粒酶活性。 3、WT組細(xì)胞生長(zhǎng)速度略快于對(duì)照組細(xì)胞；MT1、MT3及MT4組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度慢于對(duì)照組細(xì)胞；而MT2組細(xì)胞生長(zhǎng)速度與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

7、 4、0.05 μg／ml DNR處理48 h后，MT4組細(xì)胞的抑制率及凋亡率均顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，其余各組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了一個(gè)WT-hTR和四個(gè)MT-hTR真核表達(dá)重組體。 2、重組體在細(xì)胞內(nèi)能成功表達(dá)目的基因，并且MT-hTR能與細(xì)胞內(nèi)的TERT亞基結(jié)合，發(fā)揮指導(dǎo)突變端粒重復(fù)序列合成的作用。 3、在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MT-hTR能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，并提高細(xì)胞對(duì)化療藥物柔