甜高粱4CL基因的克隆、鑒定、時(shí)空表達(dá)分析及其遺傳轉(zhuǎn)化探究.pdf

1、以木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵的限速酶——4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate: CoAligase，4CL，EC6.2.1.12)為研究對象，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到水稻、擬南芥、玉米和楊樹的4CL蛋白及其編碼序列(CDS)。同時(shí)，在高粱基因組中搜索與它們同源性較高的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列，對以上序列進(jìn)行對位排列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。通過氨基酸序列比對和同源性分析，在高粱基因組中，鑒定出7個(gè)4CL類似(4CL-like)基

2、因。
　　以高粱中7個(gè)4CL類似(4CL-like)基因?yàn)閰⒄?，設(shè)計(jì)引物，以甜高粱品種‘大力士’為研究對象，克隆得到7個(gè)甜高粱中的4CL-like蛋白的編碼序列。這些序列對位排列分析顯示:它們均具有4CL蛋白保守序列BoxⅠ(SSGRRGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG);其氨基酸序列與水稻中相對應(yīng)的Os4CLs有90％左右的相似度;按照蛋白同源性關(guān)系，它們可分為4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ兩類，其中Sb07G

3、007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630屬于4CLClassⅠ,Sb04G031010屬于4CL ClassⅡ。
　　將甜高粱中7個(gè)4CL-like基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-51b(+)和pET-28a(+)中，利用大腸桿菌BL21進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白粗提液經(jīng)鎳柱純化后進(jìn)行酶活檢測及酶特性分析。酶促反應(yīng)結(jié)果表明7個(gè)甜高粱的4CL

4、蛋白都具有4-香豆酸輔酶A連接酶活力，其中甜高粱4CL ClassⅠ中的Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040蛋白對底物香豆酸、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸都具有較高的酶活力，Sb04G031010(4CL ClassⅡ)蛋白對這些底物也具有4-香豆酸輔酶A連接酶活性，但酶活力弱于4CL ClassⅠ類。4CL ClassⅠ中Sb03G000610和Sb06G016630蛋白的4CL酶活

5、力更弱，7個(gè)4CL蛋白對底物芥子酸都沒有4CL催化酶活性?？傊?，甜高粱中的這7個(gè)基因都應(yīng)屬于真正的4CL基因。
　　在甜高粱不同生長時(shí)期和不同組織部位進(jìn)行這7個(gè)4CL基因的時(shí)空表達(dá)分析。結(jié)果顯示:在根中，Sb04G005210的表達(dá)量最高，Sb07G007810次之，兩者在根中的表達(dá)量占4CL ClassⅠ類基因總表達(dá)量的93％～95％;在甜高粱葉中，Sb07G007810的表達(dá)量最高，Sb4G005210次之，兩者在葉中的表達(dá)量

6、占4CL ClassⅠ類基因總表達(dá)量的90％左右;在甜高粱莖中，Sb4G005210的表達(dá)量最高，成苗期木質(zhì)部中的表達(dá)量可占4CL ClassⅠ類基因總表達(dá)量的83％-89％;參與木質(zhì)素合成的4CL ClassⅠ類基因在植物組織生長快速期的表達(dá)量非常高，而參與類黃酮合成的4CL ClassⅡ類基因在植物受到太陽直接照射的部位表達(dá)量顯著地增加。
　　甜高粱愈傷組織的誘導(dǎo)是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因甜高粱研究的首要條件。本研究通過對不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的使

7、用和不同甜高粱部位愈傷的誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn):成熟胚（種子）愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+5 mg·L-12，4-D，胚芽胚芽愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+3 mg·L-12，4-D，胚根胚根愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+3 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1 KT，幼穗的出愈率最高，其愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+3 mg·L-12，4-D。由愈傷組織再分化結(jié)果可知，幼穗誘導(dǎo)出的愈傷組織再