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文檔簡介
1、Pde4d基因位于小鼠13號染色體,該基因的編碼產(chǎn)物是磷酸二酯酶超家族(Phosphodiesterase, PDE)成員之一。因其專一性水解細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸(cAMP),可在cAMP/CREB和cAMP/EPAC細(xì)胞信號通路中發(fā)揮重要的作用。有研究指出,Pde4d是一個(gè)父本偏好的基因,并對遺傳疾病和腫瘤發(fā)生有重要的影響,但是此研究中的SNP位點(diǎn)不能準(zhǔn)確反映Pde4d的印記特點(diǎn),且該基因與胚胎發(fā)育的關(guān)系并不十分清楚。因此,本文通過PCR
2、產(chǎn)物直接測序法對Pde4d基因座在發(fā)育中的印記特點(diǎn)進(jìn)行分析;通過了解Pde4d在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式與調(diào)控特點(diǎn),揭示其在胚胎發(fā)育中的潛在功能;并以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MS-K為研究模型,探討PDE4D對MS-K細(xì)胞增殖和遷移的影響,旨在揭示該基因可能在胚胎發(fā)育中具有的作用。
本研究為明確Pde4d在小鼠胚胎發(fā)育中的印記特點(diǎn),首先利用生物信息學(xué)對Pde4d基因座進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn),Pde4d印記報(bào)道中的SNP位于內(nèi)含子中的轉(zhuǎn)錄單元-
3、AK046832內(nèi)部,表明AK046832具有父本表達(dá)偏好的印記特點(diǎn)。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn),基因座內(nèi)部存在兩個(gè)CpG島(CGI1和CGI2)在發(fā)育過程中甲基化狀態(tài)發(fā)生了明顯改變,暗示CGI1和CGI2對Pde4d基因座的印記表達(dá)具有潛在的調(diào)控作用;其次,印記分析發(fā)現(xiàn),Pde4d、AK046832和miR-1904具有不同的印記方式,Pde4d在E9.5天全胚胎及胎盤中具有父本偏好的表達(dá)特點(diǎn),但在E15.5天的主要臟器及胎盤中呈現(xiàn)出雙等位表達(dá),而
4、AK046832和miR-1904在發(fā)育過程中表現(xiàn)為雙等位表達(dá)。這些結(jié)果表明,Pde4d在胚胎發(fā)育過程中是一個(gè)印記模式動態(tài)變化的基因。
由于Pde4d在小鼠胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)還不清楚,故本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)以及RNA原位雜交技術(shù)對該基因在胚胎和胎盤中的表達(dá)譜進(jìn)行分析。qRT-PCR結(jié)果顯示,在胚胎早期發(fā)育中,Pde4d的表達(dá)水平從2-細(xì)胞到桑椹胚階段呈現(xiàn)下降趨勢,而在囊胚中顯著降低;在中后期(E9.
5、5-E18.5)胚胎內(nèi),該基因表達(dá)升高;Pde4d在胎盤中表達(dá)穩(wěn)定并且僅在發(fā)育后期表達(dá)上調(diào)。原位雜交分析發(fā)現(xiàn),Pde4d主要在中期(E9.5-E11.5)胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)以及體節(jié)中高表達(dá),在器官形成階段(E12.5-E15.5),表達(dá)信號廣泛存在于除心臟外的主要臟器內(nèi);在胎盤發(fā)育過程中,Pde4d的表達(dá)具有動態(tài)變化的特點(diǎn),在 E11.5天胎盤中,Pde4d明顯表達(dá)在成膠質(zhì)細(xì)胞層以及迷路層,在E12.5-E15.5天,Pde4d在迷路層的表
6、達(dá)信號減弱,而在成膠質(zhì)細(xì)胞層內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)。發(fā)育至 E16.5天,位于蛻膜層內(nèi) Pde4d的表達(dá)信號開始增強(qiáng),隨著胎盤的進(jìn)一步發(fā)育,在E17.5-E18.5天胎盤的三層結(jié)構(gòu)中能明顯檢測到Pde4d的表達(dá)信號。以上結(jié)果顯示,Pde4d在胚胎和胎盤發(fā)育中是一個(gè)動態(tài)變化且廣泛表達(dá)的基因。
根據(jù) Pde4d基因座啟動子和內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄單元的特點(diǎn),本研究主要對DNA甲基化及內(nèi)含子miRNA的調(diào)控方式進(jìn)行分析。研究表明,Pde4d啟動子區(qū)內(nèi)的Cp
7、G位點(diǎn)以組織特異性甲基化的方式影響E15.5天臟器內(nèi)Pde4d的表達(dá)水平;同時(shí),在肝臟組織內(nèi),啟動子區(qū)內(nèi)的CpG位點(diǎn)以發(fā)育階段特異性甲基化的方式影響基因的表達(dá)。通過5-aza-cdR對細(xì)胞進(jìn)行去甲基化處理,進(jìn)一步證明Pde4d啟動子區(qū)內(nèi)的DNA甲基化與基因的表達(dá)水平相關(guān);此外,通過生物信息學(xué)預(yù)測及熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證,內(nèi)含子中的miR-1904能夠靶向其宿主基因Pde4d,在細(xì)胞中過表達(dá) miR-1904會抑制 Pde4d蛋白水平的
8、表達(dá),故內(nèi)含子miR-1904能夠直接調(diào)控Pde4d的表達(dá)。因此,該結(jié)果表明基因啟動子的甲基化及內(nèi)含子miR-1904是調(diào)控Pde4d表達(dá)的重要因素。
為進(jìn)一步解析Pde4d基因的功能,本研究分析了短亞型PDE4D1及長亞型PDE4D7對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。研究結(jié)果表明,過表達(dá) PDE4D1和PDE4D7能顯著抑制MS-K細(xì)胞增殖及克隆形成,并引起細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的表達(dá)上調(diào),從而導(dǎo)致細(xì)胞 G1期縮短,提前進(jìn)入 S
9、期;其次,兩個(gè)亞型均顯著降低MS-K細(xì)胞的遷移與鋪展能力,并且發(fā)現(xiàn)Vinculin基因表達(dá)上調(diào),Integrinβ1基因表達(dá)下調(diào);再次,兩個(gè)亞型引起了MS-K細(xì)胞與增殖和遷移相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào);最后,體內(nèi)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)表明,PDE4D7的過表達(dá)對MS-K細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用。以上結(jié)果均表明,PDE4D1和PDE4D7在體內(nèi)和體外都能顯著抑制MS-K細(xì)胞的增殖和遷移能力。
綜上所述,Pde4d是一個(gè)在胚胎發(fā)育中印記模式動態(tài)
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