小鼠精原細(xì)胞增殖的激素和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控及其機(jī)理的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞發(fā)育是非常復(fù)雜的過(guò)程,受到多種激素、生長(zhǎng)因子以及外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的小鼠A型精原細(xì)胞為模型,研究表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowth factor,EGF)、前列腺素E1(prostaglandin E1,PGE1)及多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfatty acid,PUFA)對(duì)A型精原細(xì)胞體外增殖的作用并探討其機(jī)理,為哺乳動(dòng)物生精細(xì)胞發(fā)育的激素和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

2、>　　 1.前列腺素和表皮生長(zhǎng)因子對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖的調(diào)控
　　 本實(shí)驗(yàn)探討了PGE1對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)理。出生6天的ICR小鼠的睪丸組織用膠原酶分散成單個(gè)細(xì)胞,建立精原細(xì)胞-體細(xì)胞體外無(wú)血清共培養(yǎng)系統(tǒng)。C-kit免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定表明所分離和培養(yǎng)的生殖細(xì)胞為A型精原細(xì)胞。增殖細(xì)胞核抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明添加了10μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8mol/L亞硒酸鈉的DMEM培養(yǎng)液(ITS

3、培養(yǎng)液)可維持A型精原細(xì)胞的存活和增殖。該系統(tǒng)經(jīng)油紅O及3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3β-HSD)染色鑒定,發(fā)現(xiàn)Sertoli細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后呈陽(yáng)性,而3β-HSD染色陽(yáng)性的Leydig細(xì)胞在體系中極少,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所建立的培養(yǎng)系統(tǒng)系由A型精原細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞組成。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用所建立的培養(yǎng)模型研究了PGE1和EGF對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖的影響,從而驗(yàn)證該培養(yǎng)模型在外源因素對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育影響研究上的適用性。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)

4、果表明EGF、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、前列腺素環(huán)氧化酶-1(cycloxygenase1,COX-1)和環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase2,COX-2)主要表達(dá)于精原細(xì)胞。EGF(10-7～10-6mol/L)或PGE1(10-8～10-6mol/L)處理均可顯著促進(jìn)精原細(xì)胞集落的形成。此外,PG受體拮抗劑SCl9220(10-6～10-5mol/L)可抑制

5、PGE1對(duì)精原細(xì)胞的促增殖作用,COX-1特異性抑制劑SC560(10-7～10-5mol/L)和COX-2特異性抑制劑NS398(10-7～10-5mol/L)均可顯著抑制EGF對(duì)精原細(xì)胞的促增殖作用。結(jié)果表明,EGF可通過(guò)促進(jìn)局部PG的產(chǎn)生來(lái)刺激精原細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果證明生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型中的精原細(xì)胞對(duì)激素以及生長(zhǎng)因子具有較好的反應(yīng)性,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的培養(yǎng)模型是一種評(píng)價(jià)A型精原細(xì)胞體外增殖調(diào)控的合適模型,可用于哺乳動(dòng)物精原

6、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究。
　　 2.多不飽和脂肪酸對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖和活性的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)探討了幾種PLJFA對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖和活性的影響,所選擇的PLJFA包括花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、亞油酸(linoleic acid,LA,n-6系列PUFA)和亞麻酸(α-linolenic acid,ALA,n-3系列PLJFA)。其中AA是一類(lèi)順式PUFA,是動(dòng)物細(xì)胞膜磷脂的重要組成部

7、分,也是PG合成的前體。本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)血清A型精原細(xì)胞體外培養(yǎng)模型探討了AA、LA和ALA對(duì)小鼠精原細(xì)胞發(fā)育及功能的影響。結(jié)果表明:單獨(dú)的AA在10-7mol/LLA在10-7～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)精原細(xì)胞集落形成有明顯的促進(jìn)作用,而更高濃度的AA與LA則不同程度地抑制精原細(xì)胞集落的形成。AA與LA的促增殖作用能夠被PG生成阻斷劑n引哚美辛(Indomethacin,10-6～10-5mol/L)所抑制,提示AA與LA的促增殖作

8、用來(lái)自于PG的合成。而10-7～10-6mol/L濃度范圍ALA對(duì)精原細(xì)胞集落無(wú)明顯促增殖,更高濃度作用下則顯著抑制精原細(xì)胞集落的增殖。待細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行四甲偶氮唑藍(lán)比色法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide法,MTT法)測(cè)定細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)AA(10-6～10-5mol/L)、LA(10-6～10-4 mol/L)以及ALA(10-6mo

9、l/L)能夠提高細(xì)胞活性,但當(dāng)AA達(dá)10-4 mol/L時(shí),細(xì)胞活性下降。PKA、PKC免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),PUFA主要通過(guò)PKC信號(hào)途徑發(fā)揮作用。此外,通過(guò)對(duì)PUFA介入精原細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究發(fā)現(xiàn),PUFA能夠增加細(xì)胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白(1aminin,LN)和細(xì)胞間連接蛋白(connexin,Cx43)的表達(dá)。上述結(jié)果表明AA與LA的促增殖作用來(lái)自于PG的合成,合適濃度的PUFA通過(guò)PKC信號(hào)通路增強(qiáng)了細(xì)胞活性,并通過(guò)促進(jìn)L

10、N和細(xì)胞間Cx43的合成以調(diào)控細(xì)胞的功能。
　　 3.小結(jié)
　　 本實(shí)驗(yàn)利用6日齡小鼠睪丸內(nèi)精原細(xì)胞與Sertoli細(xì)胞共培養(yǎng)模型,探討了PGE1、EGF以及幾種PUFA對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖及活性的影響。結(jié)果表明EGF和PGE1均可促進(jìn)精原細(xì)胞集落的形成,且PG受體拮抗劑SC19220可抑制PGE1對(duì)精原細(xì)胞的促增殖作用,COX-1抑制劑SC560和COX-2抑制劑NS398能抑制EGF促進(jìn)精原細(xì)胞增殖的作用,揭示EG

11、F可通過(guò)促進(jìn)局部PG的產(chǎn)生而刺激精原細(xì)胞的增殖。并且,AA與LA在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)精原細(xì)胞有明顯的促增殖作用,其機(jī)理可能是通過(guò)促進(jìn)PG的前體供給,對(duì)PG的產(chǎn)生有了一定的促進(jìn)作用,而更高濃度的AA與LA則抑制精原細(xì)胞的增殖。ALA對(duì)糯原細(xì)胞無(wú)明顯促增殖作用。MTT法測(cè)定細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn),AA與LA主要通過(guò)PKC信號(hào)途徑增強(qiáng)細(xì)胞的活性。此外,AA及ALA能夠增加LN和細(xì)胞間Cx43的表達(dá),提示AA及ALA通過(guò)PKC信號(hào)通路增強(qiáng)了細(xì)胞活性,并通過(guò)