缺氧誘導(dǎo)因子-1α在兒童非霍奇金淋巴瘤組織中的表達(dá)及西羅莫司對(duì)Raji細(xì)胞增殖、凋亡影響的研究.pdf

1、目的：惡性淋巴瘤是兒童期最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，非霍奇金淋巴瘤（NHL）大約占淋巴瘤總數(shù)的80％～90％，是淋巴瘤最常見的類型。NHL通常采用傳統(tǒng)化療，盡管化療效果較好，但原發(fā)耐藥和反復(fù)復(fù)發(fā)往往是影響患兒長(zhǎng)期生存的主要原因。因此，有必要尋找一種更為有效的治療措施。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor l alpha，HIF-1α）是一個(gè)在缺氧狀態(tài)下重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，控制調(diào)節(jié)各種由缺氧引起

2、的相關(guān)基因表達(dá)，參與腫瘤的惡化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，在腫瘤領(lǐng)域已成為研究熱點(diǎn)。目前認(rèn)為HIF-1α在腫瘤的發(fā)生中有重要作用，HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成緊密相關(guān)，抑制HF-1α活性可能是治療癌癥的一種途徑。體外研究表明，靶向HIF-1α的反義技術(shù)能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。西羅莫司（Sirolimus）是一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素類免疫抑制劑，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)西羅莫司有抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用很可能與西羅莫司可有效抑制HIF

3、-1α蛋白的表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)HIF-1α和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelia cell growth factor，VEGF）在兒童NHL組織中的表達(dá)情況，探討HIF-1α及VEGF在兒童NHL發(fā)病機(jī)制中的作用；并體外培養(yǎng)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞，觀察西羅莫司對(duì)Raji細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響，并檢測(cè)HIF-1α在細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討西羅莫司對(duì)惡性淋巴瘤細(xì)胞的作用及

4、其抗腫瘤的可能機(jī)制；在此基礎(chǔ)上體外研究西羅莫司聯(lián)合阿霉素（Adriamycin，ADM）對(duì)Raji細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制，為西羅莫司的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：1選取河北醫(yī)大第四醫(yī)院病理科2004年3月至2008年9月活檢及手術(shù)切除兒童NHL標(biāo)本30例，其中T細(xì)胞型13例，B細(xì)胞型17例，根據(jù)St.Jude非霍奇金淋巴瘤分期系統(tǒng)，將以上病例分為低度危險(xiǎn)組11例為Ⅰ、Ⅱ期，高度危險(xiǎn)組19例為Ⅲ、Ⅳ期。另取

5、10例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)作為對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)各組中HIF-1α和VEGF的表達(dá)情況，并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性。2體外培養(yǎng)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞，用不同濃度的西羅莫司和阿霉素進(jìn)行干預(yù)。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并計(jì)算半數(shù)生長(zhǎng)抑制劑量（IC50）。根據(jù)IC50選擇藥物的作用濃度及作用時(shí)間。3把Raji細(xì)胞分為對(duì)照組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的二甲基亞砜（DMSO）；西羅莫司組：細(xì)胞培養(yǎng)基

6、中加入DMSO溶解的西羅莫司，終濃度分別為5，10，15，20ng·mL-1；阿霉素組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入：PBS溶解的阿霉素，終濃度為10mg·L-1；西羅莫司+阿霉素組：西羅莫司終濃度為10ng·mL-1，阿霉素終濃度為10mg·L-1。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析各組中細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布的情況；同時(shí)應(yīng)用FCM和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)HIF-1α蛋白在西羅莫司各組中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1

7、 HIF-1α在對(duì)照組、低度危險(xiǎn)組和高度危險(xiǎn)組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.00％、54.55％、73.68％，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF在三組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.00％、63.64％、84.21％，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2HIF-1α在T、B細(xì)胞型兒童NHL組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.54％、70.59％，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。VEGF在兩組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.23％

8、、82.35％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示：HIF-1α和VEGF在兒童NHL組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.671，P<0.05）。4 MTT比色試驗(yàn)結(jié)果顯示：PBS及終濃度0.1％的DMSO在實(shí)驗(yàn)中對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響；西羅莫司和阿霉素對(duì)Raji細(xì)胞的抑制作用在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間劑量依賴性；藥物作用48h后阿霉素的IC50為11.47mgαL-1，西羅莫司的IC50為17.1

9、9ng·mL-1。5 MTT比色試驗(yàn)結(jié)果表明：西羅莫司各濃度組作用于Raji細(xì)胞48h后抑制率分別為25.99％、34.28％、53.08％、56.40％；阿霉素作用于Raji細(xì)胞48h后抑制率為47.47％；西羅莫司+阿霉素組作用于Raji細(xì)胞48h后抑制率為65.98％。西羅莫司各濃度組作用于Raji細(xì)胞48h后吸光度值與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P<0.05）；15，20ng·mL-1濃度組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05），其余各

10、組之間均有顯著性差異（P<0.05）。各實(shí)驗(yàn)組作用于Raji細(xì)胞48h后西羅莫司+阿霉素組吸光度值為（0.431±0.047），與單獨(dú)應(yīng)用同濃度西羅莫司組（0.832±0.071）和阿霉素組（0.601±0.041）相比均有顯著性差異（P<0.05）。6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：西羅莫司各濃度組作用于Raji細(xì)胞48h后凋亡率分別為（7.60±1.02）％、（11.32±0.95）％、（23.17±1.95）％、（32.20±1.80）％

11、；對(duì)照組凋亡率為（2.29±0.31）％。用最小顯著差法兩兩比較，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均具有顯著差異（P<0.05）。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組間西羅莫司對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響有顯著差異（P<0.05）。阿霉素作用于Raji細(xì)胞48h后凋亡率為（0.93±0.17）％，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。西羅莫司+阿霉素組作用于Raji細(xì)胞48h后凋亡率為（10.63±0.94）％；與對(duì)照組、阿霉素組相比均具有顯著差異（P<0.05），

12、與同濃度西羅莫司組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：西羅莫司各濃度組作用于Raji細(xì)胞48h后G0/G1期細(xì)胞比例分別為（57.27±1.16）％、（62.07±1.79）％、（68.67±0.06）％、（72.57±0.85）％；S期細(xì)胞比例分別為（29.67±1.00）％、（27.33±0.87）％、（21.87±0.42）％、（18.87±1.56）％；G2/M期細(xì)胞比例分別為（13.07±0.25）％、（

13、10.63±0.88）％、（9.48±0.38）％、（8.56±0.75）％。對(duì)照組處于G0/G1期，S期，G2/M期細(xì)胞比例分別為（39.97±0.74）％、（45.03±0.93）％、（15.00±0.92）％。與對(duì)照組相比，西羅莫司各濃度組細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯變化（P<0.05）。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組間西羅莫司對(duì)細(xì)胞周期的影響有顯著差異（P<0.05）。阿霉素作用于Raji細(xì)胞48h后處于G0/G1期，S期，G2/M期細(xì)胞比

14、例分別為（32.13±0.76）％、（46.40±0.72）％、（21.50±1.32）％。與對(duì)照組相比，細(xì)胞周期分布無(wú)明顯變化（P>0.05）。西羅莫司+阿霉素組作用于Raji細(xì)胞48h后G0/G1期細(xì)胞比例為（53.57±1.10）％；S期細(xì)胞比例為（32.67±1.17）％；G2/M期細(xì)胞比例為（13.77±0.15）％。與對(duì)照組、阿霉素組相比，細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯變化（P<0.05），與同濃度西羅莫司組相比無(wú)顯著差異（P>0.0

15、5）。8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：西羅莫司各濃度組作用于Raji細(xì)胞48h后HIF-1α蛋白表達(dá)定量分析F1分別為0.91±0.015，0.78±0.021，0.64±0.025，0.57±0.026。對(duì)照組HIF-1α蛋白表達(dá)FI被看作為1，西羅莫司各濃度組。HIF-1α蛋白表達(dá)率與對(duì)照組相比差異有顯著意義（P<0.05）。西羅莫司各濃度組HIF-1α蛋白表達(dá)下降。9免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示：HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿

16、，呈淡黃色至棕黃色顆粒狀，在相同光學(xué)條件下根據(jù)染色深淺判斷各組間的變化。經(jīng)西羅莫司作用后細(xì)胞胞核胞漿染色較對(duì)照組淺，顆粒減少，說(shuō)明加入西羅莫司后，HIF-1α蛋白表達(dá)降低。
　　 結(jié)論：1兒童NHL組織中存在HIF-1α和VEGF高表達(dá)情況，且HIF-1α和VEGF在兒童NHL組織中的表達(dá)呈正相關(guān)；HIF-1α→VEGF途徑可能參與兒童NHL的發(fā)病。2西羅莫司體外對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間、劑量依

17、賴性。3西羅莫司使Raji細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，抑制Raji細(xì)胞的增殖。此可能是西羅莫司抗腫瘤的作用機(jī)制之一。4西羅莫司體外可抑制Raji細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)，并呈劑量依賴關(guān)系。認(rèn)為西羅莫司誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用部分是通過(guò)下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這可能是西羅莫司抗腫瘤的另一作用機(jī)制。5西羅莫司與阿霉素聯(lián)合用藥對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且