維生素D預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)的作用與機(jī)制研究.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)是一種病因不明的腸道慢性炎癥性疾病,近年來在我國近年呈高發(fā)趨勢,高復(fù)發(fā)率是其突出特征。然而,由于基本機(jī)制不明,目前UC治療的根本目標(biāo)仍然是控制癥狀,誘導(dǎo)緩解。如何更有效的防治UC復(fù)發(fā)是臨床亟待解決的問題。
　　 近年UC發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展,給治療學(xué)提供了新的啟示。目前關(guān)于UC發(fā)病機(jī)制的基本共識是:易感個體在環(huán)境因素作用下,腸黏膜屏障削弱,腸道致病菌群及其有害成分穿過黏膜屏

2、障,和有缺陷的免疫系統(tǒng)相接觸,引發(fā)局部炎癥反應(yīng),細(xì)菌不能被及時清除,使病情遷延反復(fù)。人體腸道處于復(fù)雜的帶菌環(huán)境,腸黏膜表面積約有300m2,腸道內(nèi)大約有500種共生菌,每克結(jié)腸內(nèi)容物含有多達(dá)1012株共生菌,而易感個體腸黏膜屏障通透性顯著升高,使細(xì)菌通過腸黏膜屏障的機(jī)會增加,由此可見,對于已經(jīng)有遺傳缺陷的個體,及時清除黏附于腸壁表面和偶然突破腸黏膜屏障的致病菌是防止疾病發(fā)生和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。
　　 抗菌肽在維持腸道黏膜屏障不被細(xì)菌入

3、侵中起決定作用。它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的殺菌劑,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒和原蟲均具有殺菌作用。防御素是人體腸道最主要的抗菌肽,結(jié)腸細(xì)胞主要表達(dá)防御素-1(humanβ-defensin1,HBD-1)和防御素-2(humanβ-defensin2,HBD-2)。
　　 研究表明,維生素D在調(diào)控防御素表達(dá)中起關(guān)鍵作用,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)UC患者普遍存在維生素D缺乏,動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)維生素D受體基因敲除的小鼠更容易誘導(dǎo)出結(jié)腸炎

4、,且結(jié)腸炎癥狀因補(bǔ)充活性維生素D獲得緩解。只有活化的維生素D才具有生物學(xué)效能,然而活性維生素D即1,25-(OH)2D3循環(huán)濃度僅為0.03～0.06ng/ml,而其發(fā)揮抗菌作用所需生物作用濃度高達(dá)循環(huán)濃度數(shù)十甚至上百倍,提示維生素D可能存在一種局部活化形式。2001年Zehnder D證實(shí)結(jié)腸上皮細(xì)胞存在維生素活化的關(guān)鍵限速酶-25-羥維生素D1-α-羥化酶(25-Hydroxyvitamin D31-alpha-hydroxylas

5、e,CYP27B1),因而我們推測CYP27B1可能是維生素D對防御素局部調(diào)控的關(guān)鍵。為此我們進(jìn)行了如下研究:①收集UC患者和正常人腸黏膜組織標(biāo)本,檢測CYP27B1、防御素-2(HBD-2)在腸黏膜中的表達(dá)及其相關(guān)性;②采用過表達(dá)策略,構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-CYP27B1并感染Caco-2細(xì)胞,觀察高表達(dá)CYP27B1對Caco-2細(xì)胞HBD-2和HBD-2表達(dá)的影響;③對比觀察維生素D聯(lián)合5-氨基水楊酸(5-ASA)與單獨(dú)應(yīng)用5-

6、ASA對緩解期UC病人累積緩解率的影響,評價活性維生素D作為緩解期維持治療藥物的效能。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下三部分:
　　 第一部分 CYP27B1在潰瘍性結(jié)腸炎腸上皮組織中的表達(dá)及其與防御素-1、防御素-2的關(guān)系
　　 目的;檢測人類潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜中CYP27B1和HBD-1、HBD-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá),探討CYP27B1與防御素表達(dá)之間的關(guān)系,以及其在UC發(fā)病中的作用。
　　 方法:①依據(jù)臨

7、床資料、血液生化指標(biāo)及內(nèi)鏡表現(xiàn),選擇在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科診斷明確的活動期UC患者。②免疫組織化學(xué)方法檢測UC和正常對照結(jié)腸組織中的表達(dá)。③real-time Q-PCR方法測定UC患者和正常對照結(jié)腸上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。④Western blot檢測UC患者和正常對照結(jié)腸上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)con組:正常結(jié)腸黏膜;(2)uninfl組:

8、UC患者非炎癥結(jié)腸黏膜;(3)infl組:炎癥結(jié)腸黏膜。
　　 結(jié)論:OCYP27B1,HBD-1和HBD-2在正常對照組織和非炎癥黏膜組織及炎癥黏膜組織中的表達(dá)有顯著差異,其中CYP27B1和HBD-2在UC病變部位顯著高表達(dá),而HBD-1在UC患者正常及病變黏膜均低表達(dá)。提示三者可能參與了UC發(fā)病的病理過程;②UC患者病變部位HBD-2表達(dá)和CYP27B1的表達(dá)呈顯著正相關(guān),而HBD-1和CYP27B1的關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步證實(shí)。

9、
　　 第二部分 CYP27B1腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外促進(jìn)防御素表達(dá)的效應(yīng)觀察
　　 目的:探討CYP27B1過表達(dá)對體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞HBD-1及HBD-2的調(diào)控作用。
　　 方法:①重組腺病毒Ad-CYP27B1的構(gòu)建:從Caco-2細(xì)胞提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因CYP27B1片段,克隆至pTA2克隆載體,將測序正確的CYP27B1亞克隆至pAdTrack-CMV中后轉(zhuǎn)化含pAd

10、Easy-1的感受態(tài)BJ5183,通過同源重組獲得腺病毒載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293包裝病毒顆粒;②采用real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot方法檢測被感染的Caco-2細(xì)胞中CYP27B1的mRNA和蛋白表達(dá)以證實(shí)重組腺病毒Ad-CYP27B1的成功構(gòu)建;③采用過表達(dá)策略,以腺病毒為載體,將Ad-CYP27B1及對照空病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞,分別采用real-time Q-PCR技術(shù)及Wester

11、n blot檢測Caco-2細(xì)胞中HBD-1及HBD-2在mRNA、蛋白表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)con組,以含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,在感染步驟加入無血清無抗生素DMEM代替病毒液;(2)Ad-GFP組,感染表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空病毒Ad-GFP;(3)Ad-CYP27B1組,感染攜帶CYP27B1基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-CYP27B1

12、。
　　 結(jié)論:CYP27B1基因促進(jìn)了HBD-1及HBD-2在Caco-2細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá),從而可能增強(qiáng)結(jié)腸上皮的抗菌功能,對維持結(jié)腸黏膜屏障功能完整起到保護(hù)作用。
　　 第三部分維生素D對潰瘍性結(jié)腸炎維持緩解的作用
　　 目的:潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,uc)是臨床常見復(fù)發(fā)性疾病,目前尚無滿意的緩解期治療措施,標(biāo)準(zhǔn)治療方案僅能將1年內(nèi)累積復(fù)發(fā)率降為50％,研究顯示UC發(fā)病和維

13、生素D缺乏相關(guān)聯(lián),本研究的目的是對5-氨基水楊酸方案聯(lián)合維生素D對維持緩解的效果進(jìn)行前瞻、單盲的隨機(jī)對照觀察,探索其做為緩解期維持治療方案的可行性,為UC緩解期治療提供新的思路。
　　 方法:將52例誘導(dǎo)緩解的潰瘍性結(jié)腸病人,隨機(jī)分為維生素D+美沙拉秦組(26人)和美沙拉秦組(26人),分別給予羅鈣全0.25μg1/日+美沙拉秦500mg3/日或單獨(dú)給予美沙拉秦500mg3/日。終點(diǎn)事件為疾病復(fù)發(fā)。采用Kaplan-Meier法