人c型與g2型溶菌酶的功能研究及人c型溶菌酶制備條件優(yōu)化.pdf

1、溶菌酶是一種的先天性免疫防御因子，在集體對抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用。溶菌酶可以引起某些細(xì)菌的溶解，最近研究認(rèn)為其還可能具有其他殺菌機(jī)制。除此之外，溶菌酶還具有抑制腫瘤生長的作用。溶菌酶在自然界廣泛分布，根據(jù)對不同物種來源的溶菌酶的研究表明，溶菌酶可以分成以下六種類型：雞型(chicken type，c型)；鵝型(goose type，g型)；無脊椎動(dòng)物型(invertebrate type，i型)溶菌酶，噬菌體溶菌酶，細(xì)菌溶菌酶，植物

2、溶菌酶。人體中同時(shí)存在c型和g型兩種溶菌酶：人類的c型溶菌酶(H-LYZ)分布相當(dāng)廣泛，主要存在于體液、細(xì)胞和組織器官中。已報(bào)道含有H-LYZ的體液有眼淚、唾液、鼻涕等，在單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和心、肺、肝等組織也有分布。H-LYZ在體內(nèi)的廣泛分布說明它對人體的重要性.人體中含有兩種g型溶菌酶：g1型(H-LYGl)和g2型(H-LYG2)，同源EST數(shù)據(jù)庫搜索顯示H-LYG2基因在成人眼部和睪丸表達(dá)。
　　H-LYZ基因編碼一條14

3、8個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，其中包括18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成熟分子約14kDa。成熟的H-LYZ序列與人體類溶菌酶3(H-LYC3)的同源度為47％。同時(shí)分子中存在保守的8個(gè)半胱氨酸殘基，符合c型溶菌酶/α-乳清蛋白超基因家族結(jié)構(gòu)。H-LYZ有兩個(gè)保守的酶催化位點(diǎn)Glu-35和Asp-52。H-LYG2由我室克隆并在GenBank率先登錄(accession number AF323919)，基因組擴(kuò)展為14kb。H-LYG2分子長度為212

4、氨基酸，分子的N端有一條19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，分子量約21kDa。在分子中有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，但三個(gè)保守的催化位點(diǎn)中的一個(gè)已發(fā)生改變，即Asp-86被組氨酸取代。H-LYG2序列與其他g型溶菌酶均有一定同源度，但在114位氨基酸后與鳥類和H-LYG1的序列分歧較大。H-LYG2與H-LYZ在全長范圍內(nèi)同源度僅為9％。
　　為了對這兩種蛋白進(jìn)行初步的功能研究，必須獲得相當(dāng)數(shù)量的目的蛋白。我們將除去自身信號(hào)肽并根據(jù)酵母密碼子偏愛

5、性重新設(shè)計(jì)人工合成的H-LYZ和H-LYG2基因裝入分泌性酵母載體pPIC9K。將線性化的重組質(zhì)粒導(dǎo)入Pichia酵母菌株GS115中，定點(diǎn)整合到酵母染色體上，從而能在酵母中穩(wěn)定表達(dá).我們在發(fā)酵液上清中檢測到了活性蛋白的表達(dá)，并通過親和色譜對這兩種蛋白進(jìn)行了分離純化。本研究采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法檢測重組蛋白的殺菌活力，共選擇七株細(xì)菌供檢測用，其中革蘭氏陽性菌四株：金黃色葡萄球菌，枯草芽胞桿菌，蠟樣芽胞桿菌，溶壁微球菌，革蘭氏陰性菌兩株：

6、銅綠假單胞桿菌，大腸埃希氏球菌，真菌一株：白色念珠菌。本研究表明g型溶菌酶與c型溶菌酶對所檢測的菌株均有一定殺菌活性，但兩者的殺菌活性并不完全相同。兩者均對革蘭氏陽性菌顯示了較革蘭氏陰性菌強(qiáng)的殺菌活性，這意味著兩者都參加了人體的先天性免疫。雖然兩者的開發(fā)還處于起步階段，但已經(jīng)顯示了良好的臨床應(yīng)用前景，隨著對溶菌酶的臨床應(yīng)用研究的深入，開發(fā)出具有重要臨床價(jià)值的藥物值得期待。
　　甲殼素即2-N-乙酰氨基-2-脫氧-β-1，4-葡萄糖

7、，是由2-N-乙酰氨基-D-葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵聚合而成的直鏈含氮多糖，是與細(xì)胞壁中肽聚糖結(jié)構(gòu)極為相似的天然高分子，能夠結(jié)合溶菌酶。因此，甲殼素可以用做親和介質(zhì)純化溶菌酶。甲殼素的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是對人體無害，當(dāng)他被攝入人體后，可以被血液中的甲殼素酶降解。但未經(jīng)改造的甲殼素作為色譜介質(zhì)流速很低，這是由于甲殼素結(jié)構(gòu)致密，當(dāng)細(xì)小顆粒常常堆積在一起，這樣也使甲殼素的吸附容量較低。因此，必須經(jīng)過一定改造來改善甲殼素的流速和吸附容量。本研究即采用

8、甲殼素為原料，制備分離純化H-LYZ的親和色譜介質(zhì)。
　　研究結(jié)果表明，經(jīng)過酸堿處理后，在較低的壓力下甲殼素親和介質(zhì)也可達(dá)到較高的流速，例如在10 Psi的壓力下，乙酸溶液的流量即可達(dá)到4.5 mL/min/cm2。甲殼素親和介質(zhì)對H-LYZ具有較高的選擇性吸附，吸附容量達(dá)到2.2 mg/mL。SDS-PAGE分析顯示純化到的H-LYZ分子量約為14.6 kDa，基本與Sigma出售的人乳溶菌酶相同，略大于雞蛋清溶菌酶。在本研究設(shè)

9、計(jì)的吸附條件下用甲殼素親和色譜純化H-LYZ，經(jīng)過兩次過柱，目的蛋白被濃縮了6.9倍，總活性的收率位82％，純化效率明顯高于離子交換層析。HPLC分析顯示，純化的H-LYZ純度大于99％。
　　Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種優(yōu)良的真核表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)異源蛋白的應(yīng)用方面具有諸多優(yōu)點(diǎn)：畢赤酵母的醇氧化酶1(AOX1)基因的啟動(dòng)子具有強(qiáng)誘導(dǎo)性和強(qiáng)啟動(dòng)性，適于外源基因的高水平誘導(dǎo)表達(dá)；畢赤酵母營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成分相對簡單，

10、避免了動(dòng)物源性污染物；畢赤酵母為具有強(qiáng)烈的好氧生長偏愛性，生長迅速，可進(jìn)行細(xì)胞高密度培養(yǎng)，細(xì)胞濕重可達(dá)450 g/L以上；以及應(yīng)用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，發(fā)酵條件易于放大。為了進(jìn)一步提高目的蛋白表達(dá)水平，我們根據(jù)酵母密碼子偏愛性重新設(shè)計(jì)人工合成了H-LYZ基因。
　　在第三部分工作中，我們對影響H-LYZ分泌量的各種培養(yǎng)基成分的作用進(jìn)行了研究，最終，設(shè)計(jì)了一種廉價(jià)并且具有較好效果的培養(yǎng)基配方用于重組Pichia酵母的發(fā)酵培養(yǎng)，與實(shí)驗(yàn)室