肺炎鏈球菌中0-連接的糖基轉移酶GtfA及其激活子GtfB的結構和功能研究.pdf

1、蛋白質O-GlcNAc糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾形式，其在真核生物的生命過程中從基因轉錄、蛋白的定位、細胞內外信號調控到細胞的生長與分化、細胞間相互識別、細胞黏附、免疫保護等諸多過程中都發(fā)揮著至關重要的作用。近期的一些研究表明，O-GlcNAcylation與很多重大的慢性疾病也存在非常緊密的聯系，包括糖尿病、心血管疾病、神經退行性疾病以及癌癥等等。在原核生物中，特別是一些重要的人類致病菌中，發(fā)現細菌糖蛋白的O-GlcNAc修飾與

2、其生理學和病理學過程存在著密切的聯系。到目前為止，人們在結構上只鑒定出一種負責催化該類型修飾的糖基轉移酶O-GlcNAc transferases(OGTs)，它們具有共同的結構模式，通常N-端是由多個典型的（tetratricopeptide repeats，TPRs）34肽重復序列組成反平行的全α-螺旋結構域，而C-端具有扭曲的GT-B折疊類型的糖基轉移酶核心結構域。
　　近些年來，在革蘭氏陽性致病菌中發(fā)現一類重要的高度糖基化

3、的黏附蛋白serine-rich repeat glycoproteins(SRRPs)，它們對致病菌的黏附、免疫逃逸、增殖、生物被膜的形成以及毒理發(fā)揮過程起著關鍵作用。在對SRRPs糖基化修飾過程的研究中，發(fā)現了一類與眾不同的OGT復合體，它負責對受體SRRP蛋白進行第一步的O-GlcNAc修飾。在肺炎鏈球菌中，這類OGT復合體由GtfA和GtfB兩個蛋白組成，它們以UDP-GlcNAc為糖基供體，實現將GlcNAc糖基轉移至肺炎鏈球

4、菌中的SRRP蛋白—PsrP蛋白上。
　　在研究中，我們在對GtfA、GtfB單獨及兩者之間的復合物進行了晶體學研究過程中，分別獲得了衍射分辨率為2(A)的GtfA與UDP和GlcNAc共結晶的晶體，7(A)的GtfB晶體和4.5(A)的GtfA-GtfB復合物與產物UDP和GlcNAc共結晶的晶體。目前，已經解析了GtfA添加產物UDP和GlcNAc的復合物晶體結構，發(fā)現GtfA核心結構具有經典的GT-B折疊類型，N-端由10個

5、反平行的β-折疊片組成一個新型折疊類型的β-meader“add-on”DUF1975結構域。這種新型結構組合模式與以往單純采用經典的GT-B折疊類型的糖基轉移酶，目前已知的TPR和GT-B組合模式的hOGT/XcOGT，乃至于具有“add-on”結構域的GT-B折疊類型的糖基轉移酶結構都存在著顯著差異。我們基于結構和生化實驗證實了DUF1975結構域是一種新型的蛋白相互作用模塊，它對受體蛋白的識別結合及糖基化修飾功能的完成是必不可少的

6、。對GtfA的活性位點分析發(fā)現它采用Retaining糖基轉移酶所特有的結構特點，并進而鑒定了參與糖基轉移酶催化活性的關鍵殘基。通過體外糖基轉移酶活性測定進行催化活性測定證明了只有完整的GtfA-GtfB復合物才具有真正的OGT活性，而關鍵位點的點突變會造成活性的完全喪失。進而，通過質譜分析鑒定了完全糖基化修飾后的受體SRR1，我們發(fā)現GtfA-GtfB是一類對多位點絲氨酸具有特異修飾能力的OGT。最終，基于GtfA的結構和分子模擬結果

7、，我們提出了O-GlcNAc糖基化修飾過程中GtfA與受體可能的相互作用方式和催化機制，并基于模型進行了一系列的體內和體外糖基轉移酶活性的驗證，證明了模型的可信性和合理性。
　　綜上所述，我們對GtfA-GtfB復合體在結構和酶學功能方面的研究，揭示了原核中一類參與蛋白質糖基化修飾的新型Retaining OGT;其對絲氨酸具有特異性，而且能實現連續(xù)的多位點絲氨酸的O-GlcNAc修飾;并在酶學分類上將這類OGT分類到EC2.4.