泛素-蛋白酶系統(tǒng)在煙堿干預(yù)岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡模型中的作用研究.pdf

1、泛素蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-protease syterm,UPS)功能障礙，能夠促進(jìn)異常蛋白在神經(jīng)元聚集，故目前認(rèn)為UPS與神經(jīng)退行性病變的發(fā)病關(guān)系密切。而臨床研究和大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)煙堿對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等以大量膽堿能神經(jīng)元丟失為特征的神經(jīng)退行性疾病有保護(hù)作用。在AD病中，神經(jīng)元丟失和tan蛋白異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT

2、)是其中兩個(gè)重要的病理特征。而岡田酸(oka4aaic acid,OA)處理后的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(human neuroblastoma cell，SH-SY5Y)可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和tau蛋白異常磷酸化的改變，證明此模型可以部分模擬神經(jīng)退行性疾病的以上特征。 因此，本研究以岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡為模型，研究煙堿對(duì)岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡的干預(yù)作用，以及UPS的變化規(guī)律，探討煙堿對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用和可能的機(jī)制

3、。 本實(shí)驗(yàn)首先建立岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞死亡模型，在此模型中觀察到tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化的改變。接下來(lái)利用LDH釋放量和MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，以觀察煙堿對(duì)岡田酸誘導(dǎo)的細(xì)胞模型的影響；并輔以DNA-ladder和Hoechst33258核熒光染色觀測(cè)細(xì)胞凋亡狀況。本實(shí)驗(yàn)還用Western blot測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞Ser<'396>位點(diǎn)磷酸化tau蛋白水平和泛素蛋白表達(dá)水平，以觀察煙堿對(duì)泛素蛋白表達(dá)和對(duì)磷酸化tau蛋白

4、影響的規(guī)律。煙堿(0.1gμmol/L～100μmol/L)孵育SH-SY5Y細(xì)胞2小時(shí)和10μmol/L煙堿分別孵育細(xì)胞不同時(shí)間(0.5 h～24 h)后，均可引起細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白表達(dá)上調(diào)，煙堿濃度過(guò)大(1000μmol/L)或預(yù)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(超過(guò)24小時(shí))泛素蛋白表達(dá)反而上降，證實(shí)煙堿能劑量依賴(0.1μmol/L～100μmol/L)和時(shí)間依賴(0.5h～24h)的誘導(dǎo)泛素表達(dá)上調(diào)。該作用能被N受體α7亞型特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素

5、阻斷，因而提示煙堿上調(diào)泛素表達(dá)可能通過(guò)N受體α 7亞型介導(dǎo)。 DNA-ladder和Hoechst33258核熒光染色煙堿(0.1μmol/L～100μmol/L)都顯示25 nmol/L岡陽(yáng)酸處理細(xì)胞24小時(shí)后，可見明顯細(xì)胞凋亡；LDH和MTT的結(jié)果更表明岡田酸能時(shí)間(0.5h～24h)和劑量(1.25nmol/L～100nmol/L)相關(guān)的誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡。不同濃度煙堿(0.1μmol/L～100μmol/L)預(yù)

6、處理細(xì)胞不同時(shí)間(0.5h～6h)后，上述細(xì)胞死亡現(xiàn)象有所改善，煙堿濃度過(guò)大(達(dá)到1000μmol/L)或預(yù)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(超過(guò)6小時(shí))，細(xì)胞死亡反而加重。證實(shí)煙堿能劑量依賴(0.1μmol/L～100μmol/L)和時(shí)間依賴(0.5h～6h)，減少細(xì)胞死亡，該保護(hù)作用也能被α-銀環(huán)蛇毒素所阻斷。上述結(jié)果表明，煙堿對(duì)岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡有一定保護(hù)作用，呈明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間.效應(yīng)關(guān)系，且N受體α7亞型介導(dǎo)可能參與了煙堿的保

7、護(hù)作用。 Western-blot結(jié)果顯示，證實(shí)煙堿能劑量依賴(0.1μmol/L～100μmol/L)和時(shí)間依賴(0.5h～24h)的在岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型中誘導(dǎo)泛素表達(dá)上調(diào)，且該作用能被α-銀環(huán)蛇毒素所阻斷。25nmol/L岡田酸作用SH-SY5Y細(xì)胞24小時(shí)后可觀察到，tau蛋白ser<'396>位點(diǎn)磷酸化的程度顯著加強(qiáng)，提示岡田酸能導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化，而10μmol/L煙堿能夠降低tau蛋白磷酸化水平

8、，與模型組比較降低了25﹪(P<0.05)，說(shuō)明煙堿可部分抑制tau蛋白磷酸化。MG132作為UPS抑制劑，能夠加重?zé)焿A預(yù)孵模型組中細(xì)胞的死亡，與模型組比較細(xì)胞死亡率增加了約20﹪(P<0.05)提示煙堿可能通過(guò)UPS發(fā)揮其保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：1.煙堿可以劑量依賴(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)和時(shí)間依賴(0.5h、2h、6h、12h)地誘導(dǎo)泛素表達(dá)上調(diào)。2.煙堿可保護(hù)性的

9、干預(yù)岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白過(guò)度磷酸化和凋亡，并可在此模型中誘導(dǎo)泛素表達(dá)上調(diào)。3．煙堿誘導(dǎo)泛素表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)N受體α7亞型介導(dǎo)，提示煙堿可能通過(guò)增強(qiáng)UPS的活性，發(fā)揮其保護(hù)作用。綜上所述，我們認(rèn)為煙堿可能通過(guò)增強(qiáng)UPS活性發(fā)揮其保護(hù)作用。由于煙堿的作用廣泛而復(fù)雜，增強(qiáng)UPS活性僅為其保護(hù)作用的一個(gè)方面，深入研究煙堿以及其他UPS調(diào)節(jié)劑對(duì)維持蛋白酶體的正常功能的作用機(jī)制，將有可能為研究和開發(fā)治療AD的藥物方面提供新的線索。