U50488H對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓內(nèi)皮功能的改善作用及其機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　肺動(dòng)脈高壓(PH)是臨床上的一種嚴(yán)重的肺部血管疾病，其惡性程度高，目前被稱(chēng)為心血管疾病中的癌癥，其主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肺血管阻力的增加和肺血管重塑。PH的治療花費(fèi)昂貴，致死率高，已成為目前亟待研究并予以解決的一項(xiàng)重大難題。迄今PH沒(méi)有特效治愈方法，其治療目標(biāo)僅是延緩或者阻止病程進(jìn)展。PH種類(lèi)繁多，其中低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)主要發(fā)生在有心肺疾病的患者和生活在高海拔地區(qū)的居民和官兵，在我國(guó)有大約6000～8000萬(wàn)人口居

2、住在海拔2500m以上的地區(qū)，因此對(duì)HPH的研究得到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注，而深入研究HPH的發(fā)病機(jī)制以及探索有效的防治措施對(duì)居民的健康和保障部隊(duì)的戰(zhàn)斗力具有重要的意義。
　　HPH是一種進(jìn)展性血管病。低氧引起的血管內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是HPH的起始環(huán)節(jié)。在HPH的早期階段，低氧引起血管損傷，主要表現(xiàn)為血管收縮因子和舒張因子平衡失調(diào)，血管舒張因子NO減少，而收縮因子增加。若在可逆性階段給予干預(yù)，阻止NO減少，進(jìn)而有望改善內(nèi)皮功能，最終阻止疾

3、病的進(jìn)展。
　　課題組近年來(lái)對(duì)阿片受體在心肺血管保護(hù)方面做了大量的研究。前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)：κ-阿片受體激動(dòng)劑U50488H對(duì)HPH大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)具有舒張作用，并且此作用與NO密切相關(guān)。那么，U50488H是否能夠改善HPH大鼠的肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能？其作用機(jī)制如何？尚不清楚。此外U50488H能否改善低氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，也未見(jiàn)報(bào)道。本研究分別在整體和細(xì)胞水平研究U50488H對(duì)HPH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，以期闡

4、明阿片受體激動(dòng)劑對(duì)內(nèi)皮功能的改善作用及其機(jī)制，研究結(jié)果可為臨床應(yīng)用阿片類(lèi)物質(zhì)預(yù)防和治療HPH提供理論支持，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景。
　　【目的】
　　本研究旨在研究U50488H能否改善HPH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能，并探討其具體機(jī)制。此外在細(xì)胞模型上觀(guān)察U50488H能否減少低氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　【方法】
　　(1)健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～200g）隨機(jī)分組，分組情

5、況如下：正常組（常氧組）；低氧2周組；低氧2周+生理鹽水組；低氧2周+U50488H(1.25mg/kg)組；低氧2周+U50488H(1.25mg/kg)+nor-BNI(2.0mg/kg)組；低氧2周+nor-BNI(2.0mg/kg)組。將各組大鼠置于自制的低壓低氧艙，每天低氧8h，連續(xù)低氧2周建立HPH模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于右側(cè)頸靜脈插管經(jīng)右心房進(jìn)入右心室測(cè)量右室壓。血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量結(jié)束時(shí)經(jīng)右側(cè)頸靜脈插管內(nèi)取血，按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

6、求留取肺、肺動(dòng)脈、心臟等組織標(biāo)本。
　　(2)采用離體血管條灌流技術(shù)檢測(cè)肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能。
　　(3)采用硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO水平。
　　(4)應(yīng)用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS、iNOS和gp91phox的表達(dá)情況。
　　(5)應(yīng)用NOS活性分析試劑盒檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈eNOS和iNOS活性。
　　(6)應(yīng)用總抗氧化活性分析試劑盒檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈

7、總抗氧化活性(T-AOC)。
　　(7)建立肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）的原代和傳代培養(yǎng)。采用TUNEL法檢測(cè)U50488H對(duì)低氧時(shí)PMVECs凋亡情況的影響。
　　【結(jié)果】
　　(1)κ-阿片受體激動(dòng)劑U50488H對(duì)HPH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響
　　慢性低氧2周時(shí)，大鼠形成明顯的HPH，此時(shí)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能受損，表現(xiàn)為肺動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張劑ACh舒張反應(yīng)減弱，而對(duì)非內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張劑NaNO2卻有

8、正常的舒張反應(yīng)。在低氧2周的同時(shí)腹腔注射U50488H（1.25mg/kg）可顯著降低HPH大鼠右室壓（RVP）和右室肥厚指數(shù)（RVHI），并可顯著改善肺動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張反應(yīng)。慢性低氧2周大鼠血清NO水平顯著下降，而U50488H可顯著升高血清NO水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可被κ-阿片受體選擇性阻斷劑nor-BNI所阻斷。結(jié)果提示，U50488H可通過(guò)激動(dòng)κ-阿片受體改善HPH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能，并且同時(shí)能夠升高血清NO的水平。
　　(

9、2)U50488H對(duì)肺動(dòng)脈NO生成的影響
　　慢性低氧2周時(shí)，大鼠肺動(dòng)脈eNOS活性水平顯著降低，iNOS活性顯著升高，U50488H可升高HPH大鼠肺動(dòng)脈eNOS活性并且降低iNOS活性。此外，慢性低氧2周時(shí)大鼠肺動(dòng)脈eNOS磷酸化水平顯著降低，U50488H可提高其磷酸化水平但未檢測(cè)出其對(duì)Akt表達(dá)和磷酸化的影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可被κ-阿片受體選擇性阻斷劑nor-BNI所阻斷。表明U50488H可通過(guò)激動(dòng)κ-阿片受體提高eNOS

10、的活性和磷酸化水平進(jìn)而促進(jìn)NO的生成，該作用可能不依賴(lài)于A(yíng)kt的磷酸化。
　　(3)U50488H對(duì)肺動(dòng)脈NO破壞的影響
　　慢性低氧2周時(shí)，大鼠肺動(dòng)脈總抗氧化活性（T-AOC）顯著降低，預(yù)防性的給予U50488H可以顯著升高大鼠肺動(dòng)脈T-AOC。此外U50488H還可降低HPH大鼠肺動(dòng)脈gp91phox的過(guò)表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可被κ-阿片受體選擇性阻斷劑nor-BNI所阻斷。表明U50488H可通過(guò)激動(dòng)κ-阿片受體具有抗氧化

11、和抗硝基化效應(yīng)并可阻止NO的破壞。
　　(4)U50488H對(duì)低氧引起的PMVECs凋亡的影響
　　U50488H可顯著抑制低氧誘導(dǎo)的PMVECs的凋亡，該作用可被κ-阿片受體阻斷劑nor-BNI以及eNOS抑制劑L-NAME所阻斷，表明U50488H通過(guò)激動(dòng)κ-阿片受體產(chǎn)生的抗PMVECs凋亡作用與NO途徑有關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　(1)本研究首次發(fā)現(xiàn)κ-阿片受體激動(dòng)劑U50488H可能通過(guò)促進(jìn)NO生成，阻止N