環(huán)境雌激素DBP圍生期暴露對未成熟腦的神經(jīng)毒性及其機制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了詳細論述：
　　第一部分圍生期DBP暴露對不同發(fā)育期子代大鼠海馬神經(jīng)細胞的影響.
　　目的:在本課題組前期研究已證實500mg/(kg.d) DBP圍生期暴露對子代大鼠的學習記憶有影響的基礎上，進一步觀察該劑量DBP圍生期暴露對不同發(fā)育期子代大鼠海馬神經(jīng)細胞的影響，并探討其是否具有年齡、性別差異性，以及發(fā)育早期停止暴露后DBP對成年仔鼠海馬神經(jīng)細胞是否仍然有影響。
　　方法:SD孕鼠從孕第6天至產(chǎn)

2、后21天給予500mg/(kg.d) DBP或同等容積玉米油（正常對照組）灌胃染毒，仔鼠21天斷乳后正常喂養(yǎng)，分別于仔鼠生后5天、21天、60天取海馬檢測以下指標:①尼氏染色觀察海馬神經(jīng)細胞存活情況;②透視電鏡觀察海馬神經(jīng)細胞超微結(jié)構;③原位末端標記法(TUNEL)檢測海馬凋亡細胞;④Annexin V-PI雙參數(shù)流式細胞法檢測海馬神經(jīng)細胞死亡和凋亡情況;⑤酶標儀法檢測海馬神經(jīng)細胞Caspase-3活性。
　　結(jié)果:①尼氏染色:給

3、藥組5天及21天仔鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細胞排列紊亂、細胞輪廓不清或溶解，神經(jīng)細胞數(shù)較正常對照組明顯減少，雌雄無差異;與正常對照組仔鼠比較，給藥組5天雌雄仔鼠神經(jīng)細胞減少比例分別高達13.4％和15.3％，給藥組21天雌雄仔鼠神經(jīng)細胞減少比值分別為7.9％和4.7％，表明DBP圍生期暴露導致海馬神經(jīng)細胞丟失，且新生鼠較幼年鼠更明顯;而給藥組60天仔鼠與對照組比較雖然有所降低，但無統(tǒng)計學差異。②透視電鏡:給藥組21天的雌、雄仔鼠海馬神經(jīng)細胞均出現(xiàn)

4、線粒體腫脹、空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張改變;給藥組60天的雌、雄仔鼠神經(jīng)細胞超微結(jié)構未見明顯異常改變。③TUNEL法檢測海馬細胞凋亡:給藥組5天、21天仔鼠海馬凋亡細胞較對照組明顯增多，而給藥組60天仔鼠與對照組比較無顯著差異，雌雄仔鼠間凋亡細胞無差異。④Annexin V-PI法檢測海馬神經(jīng)細胞死亡和凋亡情況:給藥組5天雌雄仔鼠海馬死亡細胞比例均較對照組增高，P＜0.01;給藥組5天、21天仔鼠海馬凋亡細胞比例較對照組明顯增高，雌雄無差異，P

5、均＜0.001。與同齡同性別正常對照比較，給藥組5天雌雄仔鼠凋亡細胞增加比值分別高達278.4％和376.4％，而給藥組21天雌雄仔鼠增加比值分別為169.8％和159.1％，表明DBP圍生期暴露導致的海馬細胞過度凋亡新生鼠較幼年鼠更明顯。給藥組60天仔鼠海馬凋亡細胞比例與對照組比較有增高，但無統(tǒng)計學差異。⑤海馬神經(jīng)細胞Caspase-3活性檢測:給藥組5天、21天仔鼠海馬Caspase-3活性均較對照組明顯增高，雌雄間無差異;與同齡同

6、性別正常對照比較，給藥組5天雌雄仔鼠海馬細胞caspase-3活性增加比值分別高達130.1％和166.1％，而給藥組21天雌雄仔鼠增加比值分別為39.6％和38.2％，再次表明DBP圍生期暴露導致的海馬細胞過度凋亡新生鼠較幼年鼠更明顯;給藥組60天仔鼠與對照組比較無顯著差異。
　　結(jié)論:①500mg/(kg·d)DBP圍生期染毒可導致新生鼠和幼年鼠海馬神經(jīng)細胞壞死和過度凋亡，年齡越小，損害越重，這可能是DBP導致發(fā)育期大鼠學習記

7、憶功能障礙的原因之一。②DBP對海馬神經(jīng)細胞的毒性效應未見明顯性別差異。③發(fā)育早期脫毒后，DBP未對成年腦海馬神經(jīng)細胞造成明顯損傷。
　　第二部分圍生期DBP暴露對未成熟期子代大鼠海馬突觸的影響。
　　目的:觀察DBP圍生期暴露對未成熟期子代大鼠海馬突觸結(jié)構和功能的影響，并分析性別差異性及發(fā)育早期脫毒后的變化。
　　方法:模型建立及分組方法同第一部分，分別于仔鼠生后21天、60天取海馬進行檢測:①免疫組化及Wester

8、n blot方法分析子代大鼠海馬突觸素的表達變化。②電鏡觀察海馬突觸超微結(jié)構。⑧觀察海馬突觸CA1區(qū)長時程增強的變化。
　　結(jié)果:①海馬突觸素表達:正常對照組60天雌雄仔鼠的海馬突觸素表達較21天同性別仔鼠明顯增高，P均＜0.001;給藥組21天仔鼠海馬突觸素表達較對照組明顯降低，雌雄無差異，P均＜0.01;而給藥組60天仔鼠突觸素表達與對照組比較雖有降低，但無統(tǒng)計學差異。②電鏡觀察海馬超微結(jié)構:與對照組比較，給藥組21天雌雄仔鼠

9、海馬突觸均呈現(xiàn)出數(shù)量減少、突觸前囊泡減少、突觸后致密物變薄的變化趨勢，而給藥組60天仔鼠海馬突觸無明顯類似改變。③海馬CA1區(qū)錐體細胞突觸長時程增強的變化:無論雌雄，HFS后正常對照組60天仔鼠fEPSP的斜率和幅度變化均較正常對照組21天仔鼠增高，P均＜0.05;給藥組21天雌雄仔鼠HFS后的fEPSP斜率及幅度變化均較對照組顯著降低;而給藥組60天仔鼠HFS后的fEPSP的斜率和幅度變化與正常對照組比較同樣有所下降，但仍然無統(tǒng)計學差

10、異。各組間雌雄無差異。
　　結(jié)論:①500mg/(kg·d)DBP圍生期暴露可明顯損害幼年子代大鼠海馬突觸結(jié)構和突觸傳遞效能，無性別差異性，這可能是DBP導致發(fā)育期子代大鼠學習記憶功能障礙的另一個重要原因。②500mg/(kg·d)DBP圍生期暴露仔鼠成年后的海馬突觸結(jié)構及突觸傳遞效能雖有輕微異常，但與正常對照比較沒有統(tǒng)計學意義，提示發(fā)育早期脫離污染后，DBP對成年腦海馬突觸沒有明顯影響。
　　第三部分圍生期DBP暴露致子代

11、大鼠神經(jīng)毒性的可能機制。
　　目的:觀察DBP暴露后子代大鼠的血清性激素水平變化、海馬AROM及ER-β的表達水平，以及與ER-β信號途經(jīng)相關的兩個重要蛋白p-CREB、BDNF的表達變化，探討DBP神經(jīng)毒性可能機制。
　　方法:模型建立及分組方法同第一部分，分別于仔鼠生后21天、60天取血清和海馬進行檢測:①化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測子代大鼠血清中的睪酮和雌二醇水平;②采用免疫組化及Western blot方法分析子代大鼠海馬

12、AROM、ER-β、p-CREB、BDNF的表達變化。
　　結(jié)果:①血清性激素水平變化:給藥組21天、60天雄鼠及21天雌鼠血清睪酮水平較同齡對照組低，而21天、60天雌雄大鼠雌激素水平均較對照組增高。②海馬AROM、ER-β、p-CREB、BDNF表達的變化:與對照組仔鼠比較，給藥組21天仔鼠的AROM的表達增高，而ER-β、p-CREB、BDNF的表達均降低，雌雄無顯著差異;而給藥組60天仔鼠各指標與對照組比較無顯著差異。

13、r>　　結(jié)論:①DBP圍生期暴露降低了雌雄子代大鼠的睪酮水平，且雄性子代大鼠的睪酮降低持續(xù)至成年期;而幼年雌雄子代大鼠血清雌激素水平均增高，一直持續(xù)至成年。②DBP圍生期暴露上調(diào)了幼年子代大鼠海馬AROM表達，而抑制了ER-β、p-CREB及BDNF的表達。血清睪酮水平的降低及海馬腦區(qū)ER-β的表達下調(diào)導致p-CREB依賴性BDNF雌激素效應的降低，可能是DBP導致海馬神經(jīng)細胞毒性及突觸可塑性損害的關鍵原因。③DBP對海馬AROM、ER