CREB介導(dǎo)的Mipu1表達上調(diào)及其在心肌缺血后適應(yīng)中的作用.pdf

1、心肌缺血后適應(yīng)是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的心肌內(nèi)源性保護現(xiàn)象,可明顯減輕缺血-再灌注所致的心律失常,改善心肌功能,減少心肌梗死面積。但對其心肌保護機制目前尚不完全清楚。深入探討缺血后適應(yīng)的心肌保護機制將為心肌損傷的防治研究提供新的思路。Mipu1是本室從缺血預(yù)適應(yīng)大鼠心肌中分離的新基因。本室前期研究發(fā)現(xiàn)Mipu1在缺血-再灌注及缺血預(yù)適應(yīng)心肌中表達增加,且對氧化應(yīng)激所致的心肌細胞損傷具有保護作用。但Mipu1在心肌缺血后適應(yīng)中的表達發(fā)生何種變化

2、,其表達調(diào)控機制是什么,是否具有心肌保護作用等目前尚不清楚。本課題是在本實驗室前期工作的基礎(chǔ)上,采用大鼠心肌缺血后適應(yīng)動物模型、心肌細胞H9c2過氧化氫損傷及缺氧后適應(yīng)的細胞模型,探討Mipu1在心肌缺血后適應(yīng)心肌中的表達模式,并探討轉(zhuǎn)錄因子CREB在心肌缺血后適應(yīng)中對Mipu1表達的調(diào)控作用及其心肌保護作用和機制。主要方法與結(jié)果如下:1.采用在體大鼠,結(jié)扎左冠狀動脈前降支45min,再灌注9h制備心肌缺血-再灌注損傷模型,并在再灌注9

3、h前行再灌注30s缺血30s(重復(fù)三次),制備心肌缺血后適應(yīng)模型;檢測血清酶學(xué)指標、心肌梗死面積和Caspase-3活性以評價心肌受損情況;采用生物信息學(xué)技術(shù)分析Mipu1基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;采用Real-time PCR和Western-blot檢測心肌中CREB和Mipu1的表達。
　　結(jié)果顯示:(1).缺血后適應(yīng)可明顯減輕缺血-再灌注所致的心肌損傷,表現(xiàn)為血清酶學(xué)指標下降,心肌梗死面積減少,心肌Caspase-3

4、活性明顯降低;(2).缺血-再灌注損傷導(dǎo)致心肌中Mipu1的mRNA和蛋白水平以及磷酸化CREB蛋白水平的上調(diào),缺血后適應(yīng)可進一步上調(diào)大鼠心肌中Mipu1和磷酸化CREB的表達;(3).生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Mipu1基因啟動子區(qū)含有CREB、HSF1和Elkl等多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件。2.采用熒光素酶報告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)心肌細胞缺氧后適應(yīng)通過激活cAMP/PKA信號通路而導(dǎo)致CREB的磷酸化和活化,活化的CREB與Mipu

5、1啟動子區(qū)的第二個CREB結(jié)合元件(CREⅡ)相結(jié)合,增加Mipu1啟動子活性從而上調(diào)Mipu1的表達;進一步采用RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)改變CREB的表達水平,探討了缺氧后適應(yīng)時CREB對Mipu1表達的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,抑制CREB表達可明顯抑制缺氧后適應(yīng)所致的Mipu1的表達上調(diào);而過表達CREB可增強缺氧后適應(yīng)所致的Mipu1的表達上調(diào)。3.大鼠H9c2心肌細胞經(jīng)過氧化氫或缺氧后適應(yīng)處理,采用基因轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術(shù)同時改變C

6、REB和Mipu1的表達水平,采用MTT法、LDH活性分析、Caspase-3活性檢測及凋亡百分率檢測細胞受損情況,以探討CREB所調(diào)控的Mipu1表達在氧化應(yīng)激及缺氧后適應(yīng)時對心肌細胞的保護作用。
　　結(jié)果顯示:(1).過表達CREB可以抑制由H2O2所引起的細胞死亡和凋亡,并下調(diào)LDH和Caspase-3活性,但在過表達CREB的同時采用RNA干擾技術(shù)抑制Mipu1的表達,則上述心肌細胞的保護作用被部分取消。與此相反,采用RN

7、A干擾技術(shù)抑制CREB表達能進一步促進由H202所引起的心肌細胞死亡和凋亡,以及上調(diào)LDH和Caspase-3活性,但在抑制CREB表達的同時上調(diào)Mipu1表達則可減輕H202所致的心肌細胞損傷。(2).缺氧后適應(yīng)可減輕缺氧-復(fù)氧所致的心肌細胞損傷,表現(xiàn)為細胞存活率增加,LDH釋放減少,細胞凋亡減少及Caspase-3活性降低。過表達CREB可增強缺氧后適應(yīng)的上述保護作用,但此作用可被Mipu1的RNA干擾所減弱。與此相反,抑制CREB