核因子kappaBp65蛋白及ENA-78在子宮內膜異位癥發(fā)病中的作用研究.pdf

1、研究背景： 子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMs)簡稱內異癥，發(fā)病率約占生育年齡婦女的15％，近年來有明顯上升趨勢。內異癥所引起的痛經、下腹痛及不孕癥，嚴重地影響了婦女的健康和生活質量，其病變廣泛，形態(tài)多樣，且有浸潤性生長、廣泛種植轉移和易復發(fā)的惡性生物學行為，是一種常見且難治的婦產科疾病。目前診斷主要以微創(chuàng)的腹腔鏡檢查為金標準，但缺乏特異性的生化指標；治療方法主要采用外科去勢手術和激素治療，這些方法雖對減輕癥狀，

2、促進妊娠有一定幫助，但效果有限，副作用明顯，且易復發(fā)，無法根治。影響內異癥臨床治療效果的主要原因是本病的發(fā)病機制不清楚。因此，內異癥發(fā)病機制的研究是當前婦產科基礎研究的熱點之一。已有的研究表明異位內膜的轉移、種植、生長等類似腫瘤轉移的生物學行為是內異癥發(fā)病關鍵。 核轉錄因子kappaB(NF—κB)是一種廣泛存在的多效性的核轉錄因子，為Rel蛋白家族成員，由多肽P50和P65亞基形成同源或異源性二聚體。在靜息細胞，NF—κB主要

3、位于細胞漿，與具有抑制作用的Iκ B家族結合，其錨蛋白重復序列掩蓋了NF—κB的DNA結合位點而干擾NF—κB的功能，在受到生理或有害刺激后，依靠信號傳導系統由無活性狀態(tài)轉變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，激活后的NF—κB從NF—κB—Iκ Bs復合物中解離，進入細胞核，與相應的靶基因結合，啟動轉錄。其活化過程不需要合成新的蛋白，故能及時引起細胞反應早期的功能變化，繼發(fā)引起其他因子的產生和活化。NF—κB可高效誘導多種前炎性細胞因子、白細胞粘附分子、單核

4、細胞趨化因子等基因的表達，同時對參與炎癥級聯及放大效應的多種酶的基因轉錄也具有重要的調控作用。NF—κB的過度激活可引起一系列炎癥相關性疾病，如哮喘、類風濕性關節(jié)炎、腸炎、癌癥等，已引起人們的高度重視。 上皮細胞來源的中性粒細胞活化肽-78(簡稱ENA-78)是一種重要的趨化因子及血管形成因子，其可趨化中性粒細胞到達病灶以及直接促進異位內膜細胞的增殖，近年來對其在內異癥發(fā)病中的作用日益受到重視。 研究表明，ENA-78是

5、NF—κB的下游基因，是受到NF—κB調控的基因。但是NF—κB對ENA-78的調控在內異癥中是否起作用尚不清楚。 第一部分子宮內膜異位癥體外細胞模型的建立 研究對象：正常婦女的子宮內膜細胞；子宮內膜異位癥患者的在位及異位內膜細胞 目的：探索人正常、在位及異位子宮內膜細胞體外原代及傳代培養(yǎng)的方法，建立子宮內膜異位癥體外細胞模型 方法：收集子宮內膜異位癥和正常婦女的在位及異位子宮內膜，采用膠原酶和銅網過篩法

6、及差時貼壁等方法分離子宮內膜基質細胞和腺上皮細胞，進行單層培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，免疫細胞化學進行細胞鑒定，MTT法繪制細胞生長曲線。 結果：子宮內膜腺上皮細胞(Endometrial epithelial cell，EEC)和基質細胞(Endomet-rial stromal cell，ESC)分別經角蛋白單抗和波形蛋白單抗組化染色為陽性，腺上皮可持續(xù)培養(yǎng)4-6周，傳代2-3次；基質細胞可持續(xù)培養(yǎng)5-8周，傳代4-6

7、次。 結論：采用膠原酶消化、篩網二次過濾和貼壁純化等方法，分離出高純度的子宮內膜腺上皮細胞和基質細胞而沒有細胞特征的改變。可為研究子宮內膜異位癥相關病理生理機制提供滿意的體外細胞平臺。 第二部分 NF-KBp65蛋白、ENA-78在子宮內膜異位癥發(fā)病中的作用研究 目的：檢測核因子kappaBp65蛋白及ENA-78在內異癥患者在位內膜、異位內膜和正常子宮內膜中的表達情況，探討上述因子與內異癥發(fā)病的關系。

8、方法： (1)體外傳代培養(yǎng)至第3代的在位、異位及正常內膜細胞分別給予不同濃度的IL-1β及IL-1β+二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)進行干預。用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測三組子宮內膜培養(yǎng)上清液ENA-78濃度及IL-1β、IL-1β+PDTC對各組內膜基質細胞分泌ENA-78濃度的影響。 (2)用免疫細胞化學方法檢測三組子宮內膜細胞NF—KBp65蛋白的活化程度及IL-1β、IL-1β+PDTC干預下各

9、組內膜基質細胞NF-KBp65蛋白的活化程度的改變。 結果： (1)在位及異位子宮內膜細胞培養(yǎng)上清液中ENA-78濃度明顯高于正常子宮內膜細胞，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；在位及異位子宮內膜細胞之間比較，異位子宮內膜細胞培養(yǎng)上清液中的ENA-78濃度高于在位子宮內膜細胞，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，在分別給予IL-1β、IL-1β+PDTC干預后，正常子宮內膜細胞上清液中的ENA-78濃度無明顯變化，

10、差異無統計學意義(P＞0.05)：而在在位及異位內膜細胞的上清液中，ENA-78濃度在IL-1β組最高，明顯高于對照組及IL-1β+PDTC組，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。 (2)在子宮內膜細胞、在位及異位子宮內膜細胞這三組中，在位內膜細胞及異位內膜細胞的NF—KBp65蛋白的活化程度顯著高于正常子宮內膜細胞，差異有統計學意義(P＜0.05)；在位及異位子宮內膜細胞NF-KBp65蛋白的活化程度IL-1β組最高，顯著高

11、于對照組及IL-1β+PDTC組，差異有統計學意義。IL-1β能顯著誘導內異癥異位及在位內膜間質細胞NF—κB的活化，這種作用能被PDTC所抑制。PDTC能明顯抑制IL-1β誘導內異癥異位及在位內膜基質細胞分泌ENA-78的作用。 結論： (1)NF—κBp65、ENA-78可能在內異癥發(fā)病中起作用。 (2)IL-1β可誘導在位及異位子宮內膜細胞NF—κBp65活化，使ENA-78的表達增高。PDTC可抑制此作用