核因子kappaBp65蛋白及ENA-78在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用研究.pdf

1、研究背景： 子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)簡稱內(nèi)異癥，發(fā)病率約占生育年齡婦女的15％，近年來有明顯上升趨勢。內(nèi)異癥所引起的痛經(jīng)、下腹痛及不孕癥，嚴(yán)重地影響了婦女的健康和生活質(zhì)量，其病變廣泛，形態(tài)多樣，且有浸潤性生長、廣泛種植轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)的惡性生物學(xué)行為，是一種常見且難治的婦產(chǎn)科疾病。目前診斷主要以微創(chuàng)的腹腔鏡檢查為金標(biāo)準(zhǔn)，但缺乏特異性的生化指標(biāo)；治療方法主要采用外科去勢手術(shù)和激素治療，這些方法雖對減輕癥狀，

2、促進(jìn)妊娠有一定幫助，但效果有限，副作用明顯，且易復(fù)發(fā)，無法根治。影響內(nèi)異癥臨床治療效果的主要原因是本病的發(fā)病機(jī)制不清楚。因此，內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制的研究是當(dāng)前婦產(chǎn)科基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。已有的研究表明異位內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移、種植、生長等類似腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為是內(nèi)異癥發(fā)病關(guān)鍵。 核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF—κB)是一種廣泛存在的多效性的核轉(zhuǎn)錄因子，為Rel蛋白家族成員，由多肽P50和P65亞基形成同源或異源性二聚體。在靜息細(xì)胞，NF—κB主要

3、位于細(xì)胞漿，與具有抑制作用的Iκ B家族結(jié)合，其錨蛋白重復(fù)序列掩蓋了NF—κB的DNA結(jié)合位點(diǎn)而干擾NF—κB的功能，在受到生理或有害刺激后，依靠信號傳導(dǎo)系統(tǒng)由無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，激活后的NF—κB從NF—κB—Iκ Bs復(fù)合物中解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄。其活化過程不需要合成新的蛋白，故能及時(shí)引起細(xì)胞反應(yīng)早期的功能變化，繼發(fā)引起其他因子的產(chǎn)生和活化。NF—κB可高效誘導(dǎo)多種前炎性細(xì)胞因子、白細(xì)胞粘附分子、單核

4、細(xì)胞趨化因子等基因的表達(dá)，同時(shí)對參與炎癥級聯(lián)及放大效應(yīng)的多種酶的基因轉(zhuǎn)錄也具有重要的調(diào)控作用。NF—κB的過度激活可引起一系列炎癥相關(guān)性疾病，如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎、癌癥等，已引起人們的高度重視。 上皮細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞活化肽-78(簡稱ENA-78)是一種重要的趨化因子及血管形成因子，其可趨化中性粒細(xì)胞到達(dá)病灶以及直接促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，近年來對其在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用日益受到重視。 研究表明，ENA-78是

5、NF—κB的下游基因，是受到NF—κB調(diào)控的基因。但是NF—κB對ENA-78的調(diào)控在內(nèi)異癥中是否起作用尚不清楚。 第一部分子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞模型的建立 研究對象：正常婦女的子宮內(nèi)膜細(xì)胞；子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞 目的：探索人正常、在位及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外原代及傳代培養(yǎng)的方法，建立子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞模型 方法：收集子宮內(nèi)膜異位癥和正常婦女的在位及異位子宮內(nèi)膜，采用膠原酶和銅網(wǎng)過篩法

6、及差時(shí)貼壁等方法分離子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞，進(jìn)行單層培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定，MTT法繪制細(xì)胞生長曲線。 結(jié)果：子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(Endometrial epithelial cell，EEC)和基質(zhì)細(xì)胞(Endomet-rial stromal cell，ESC)分別經(jīng)角蛋白單抗和波形蛋白單抗組化染色為陽性，腺上皮可持續(xù)培養(yǎng)4-6周，傳代2-3次；基質(zhì)細(xì)胞可持續(xù)培養(yǎng)5-8周，傳代4-6

7、次。 結(jié)論：采用膠原酶消化、篩網(wǎng)二次過濾和貼壁純化等方法，分離出高純度的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞而沒有細(xì)胞特征的改變?？蔀檠芯孔訉m內(nèi)膜異位癥相關(guān)病理生理機(jī)制提供滿意的體外細(xì)胞平臺。 第二部分 NF-KBp65蛋白、ENA-78在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用研究 目的：檢測核因子kappaBp65蛋白及ENA-78在內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況，探討上述因子與內(nèi)異癥發(fā)病的關(guān)系。

8、方法： (1)體外傳代培養(yǎng)至第3代的在位、異位及正常內(nèi)膜細(xì)胞分別給予不同濃度的IL-1β及IL-1β+二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)進(jìn)行干預(yù)。用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測三組子宮內(nèi)膜培養(yǎng)上清液ENA-78濃度及IL-1β、IL-1β+PDTC對各組內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分泌ENA-78濃度的影響。 (2)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測三組子宮內(nèi)膜細(xì)胞NF—KBp65蛋白的活化程度及IL-1β、IL-1β+PDTC干預(yù)下各

9、組內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞NF-KBp65蛋白的活化程度的改變。 結(jié)果： (1)在位及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ENA-78濃度明顯高于正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；在位及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞之間比較，異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ENA-78濃度高于在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在分別給予IL-1β、IL-1β+PDTC干預(yù)后，正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞上清液中的ENA-78濃度無明顯變化，

10、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)：而在在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞的上清液中，ENA-78濃度在IL-1β組最高，明顯高于對照組及IL-1β+PDTC組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 (2)在子宮內(nèi)膜細(xì)胞、在位及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞這三組中，在位內(nèi)膜細(xì)胞及異位內(nèi)膜細(xì)胞的NF—KBp65蛋白的活化程度顯著高于正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在位及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞NF-KBp65蛋白的活化程度IL-1β組最高，顯著高

11、于對照組及IL-1β+PDTC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β能顯著誘導(dǎo)內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NF—κB的活化，這種作用能被PDTC所抑制。PDTC能明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分泌ENA-78的作用。 結(jié)論： (1)NF—κBp65、ENA-78可能在內(nèi)異癥發(fā)病中起作用。 (2)IL-1β可誘導(dǎo)在位及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞NF—κBp65活化，使ENA-78的表達(dá)增高。PDTC可抑制此作用