脂聯(lián)素(AdipoQ)及其受體(AdipoR1-2)對山羊脂肪沉積的作用機(jī)制研究.pdf

1、本試驗(yàn)?zāi)康氖茄芯緼dipoQ、AdipoR1和AdipoR2對山羊脂肪沉積的作用機(jī)制，為后續(xù)通過AdipoQ來調(diào)控山羊肌肉中的脂肪酸合成，改善山羊肉品質(zhì)提供依據(jù)。試驗(yàn)克隆得到南江黃羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的全長編碼區(qū)序列。利用半定量RT-PCR檢測3個基因在山羊11個組織（皮下脂肪、背最長肌、股二頭肌、腓腸肌、卵巢、子宮、腦、瘤胃、腎臟、肝臟和心臟）中的表達(dá)模式。利用qPCR檢測AdipoQ、Adipo R1和

2、AdipoR2基因在南江黃羊出生后5個發(fā)育階段(3d、30d、60 d、90 d和120 d)背最長肌中mRNA的相對表達(dá)量。利用含高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基(25 mM/L)誘導(dǎo)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal muscle satellite cells，SMSCs)向脂肪細(xì)胞分化，油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪滴的沉積，qPCR檢測AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相關(guān)基因的相對表達(dá)量。構(gòu)建AdipoQ基因

3、過表達(dá)載體pEGFP-N1-AD，并在山羊SMSCs中過表達(dá)AdipoQ基因。熒光顯微鏡檢測融合蛋白的亞細(xì)胞定位，qPCR檢測AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相關(guān)基因的相對表達(dá)量。結(jié)果如下:
　　(1)克隆得到南江黃羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的CDS區(qū)全序列（GenBank登錄號分別為JX573539、KC286912和JX573540）。CDS區(qū)全長分別為720 bp、1128 bp和

4、1176 bp，編碼氨基酸數(shù)分別為239、375和391。南江黃羊與人、牛和豬AdipoQ基因核苷酸序列的一致性達(dá)到85％、97％和88％;AdipoR1基因核苷酸序列一致性為87％、97％和90％; AdipoR2基因核苷酸序列一致性為86％、97％和88％，表明3個基因在物種間高度保守。
　　(2)半定量RT-PCR檢測到AdipoQ基因mRNA在脂肪組織中表達(dá)量最高，在肌肉組織和肝臟中表達(dá)量相對較低，其它組織中無表達(dá)。Adi

5、poR1基因mRNA在所有組織中都有表達(dá)，在肌肉組織、瘤胃、脂肪組織中表達(dá)量較高，其它組織中表達(dá)量較低。AdipoR2基因mRNA同樣在所有組織中都有表達(dá)，在脂肪組織、肌肉組織中表達(dá)量相對較高，在其它組織中表達(dá)量較低。3個基因主要在脂肪組織和肌肉組織中表達(dá)，表明3個基因在這些組織中起到重要作用。
　　(3)利用qPCR檢測南江黃羊背最長肌(3d、30d、60 d、90 d和120 d) AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2

6、基因mRNA的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在南江黃羊公、母羊背最長肌中AdipoQ的表達(dá)相似，呈上升-下降-上升趨勢，公羊中3d時表達(dá)量最低(P＜0.05)，120 d時表達(dá)量最高(P＜0.05);母羊中3d時表達(dá)量最低(P＜0.05)，60 d時表達(dá)量最高(P＜0.05)。AdipoR1在南江黃羊公羊背最長肌中表達(dá)趨勢為下降-上升，在60 d時表達(dá)量最高(P＜0.05)，90 d時表達(dá)量最低(P＜0.05);母羊中表達(dá)趨勢為下降-上升-下降，在3

7、0 d時表達(dá)量最低(P＜0.05)，60 d時表達(dá)量最高(P＜0.05)。AdipoR2在南江黃羊公、母羊背最長肌中表達(dá)趨勢分別為下降-上升和下降-上升-下降，都是在30d時表達(dá)量最低(P＜0.05)，90 d時表達(dá)量最高(P＜0.05)。
　　(4)山羊SMSCs在高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)下合成脂肪酸，油紅O染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)6d后開始出現(xiàn)少量脂肪滴沉積，培養(yǎng)至10d時細(xì)胞內(nèi)沉積大量脂肪滴，而低糖組無明顯脂肪滴沉積。同時qPCR檢測到脂肪酸合成

8、及成脂分化相關(guān)基因ACC、FAS、C/EBPα、PPARγ和SREBP-1表達(dá)量均顯著性升高，表明高糖能上調(diào)SMSCs中上述基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸合成及向類脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在成脂分化過程中AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2表達(dá)量也有顯著上升，表明AdipoQ及其受體基因可能參與了脂肪酸合成及成脂分化的調(diào)控。
　　(5)在山羊SMSCs中過表達(dá)AdipoQ基因，發(fā)現(xiàn)AdipoQ融合蛋白只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，表明AdipoQ主要在