CD13單鏈抗體和AGAP重組蛋白真核表達(dá)及對(duì)NB4細(xì)胞的殺傷作用.pdf

1、目的：本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)方法，構(gòu)建含重組編碼CD13單鏈抗體和蝎毒素鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽AGAP（analgesic antitumoral peptide，AGAP）融合蛋白基因的真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞中表達(dá)并純化融合蛋白，并研究CD13-AGAP融合蛋白對(duì)CD13陽性白血病細(xì)胞株NB4影響。 方法：從東亞鉗蝎蝎尾中PCR擴(kuò)增東亞鉗蝎活性肽AGAP的編碼基因，酶切后插入真核表達(dá)載體pSecTag2/CD13/RFP，連接轉(zhuǎn)

2、化，酶切鑒定后得到pSecTag2/CD13/AGAP重組真核表達(dá)載體。測(cè)序鑒定后，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過RT-PCR和免疫印跡方法檢測(cè)融合基因和蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)。進(jìn)一步用ProBondTM Nickel-Chelating Resin純化柱結(jié)合并純化真核表達(dá)融合蛋白CD13-AGAP，低溫凍干濃縮融合蛋白表達(dá)純化融合蛋白。將CD13-RFP融合蛋白作用NB4細(xì)胞，室

3、溫孵育30 min，流式檢測(cè)細(xì)胞紅色熒光蛋白表達(dá)，分析CD13-RFP單鏈抗體融合蛋白特異性結(jié)合CD13陽性NB4細(xì)胞的能力；將CD13-RFP和CD13-AGAP融合蛋白作用CD13陽性白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞，CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD13-AGAP融合蛋白對(duì)NB4白血病細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果： （1）酶切及測(cè)序結(jié)果證實(shí)pSecTag2/CD13/AGAP重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功； （2）

4、將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后分別收集細(xì)胞總RNA和蛋白，RT-PCR和免疫印跡方法結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒得到有效表達(dá)； （3）大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了CD13-AGAP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞，液氮和42℃水浴反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，用ProBondTM Nickel-Chelating Resin純化柱結(jié)合并純化真核表達(dá)融合蛋白CD13-AGAP，低溫凍干濃縮融合蛋白； （4）流式檢測(cè)CD13-RFP單鏈抗體融合蛋白特異

5、性結(jié)合CD13陽性NB4細(xì)胞，將CD13-RFP融合蛋白加入到1×105NB4細(xì)胞，室溫孵育30 min，流式檢測(cè)細(xì)胞紅色熒光蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有42%細(xì)胞CD13陽性，證明真核表達(dá)的CD13-RFP可以有效結(jié)合CD13陽性NB4細(xì)胞。 （5）將融合蛋白CD13單鏈抗體和CD13單鏈抗體AGAP融合蛋白作用白血病CD13陽性細(xì)胞株NB4，96 h后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制分別為16．3%和42．8%； （6）流式細(xì)胞儀分析CD

6、13-AGAP融合蛋白對(duì)NB4細(xì)胞周期的影響，融合蛋白CD13-AGAP處理NB4細(xì)胞后，使細(xì)胞周期G1期比例從對(duì)照的42．26%增加到55．97%多，S期從53．67%減少到38．18%。 結(jié)論： （1）成功構(gòu)建了融合蛋白真核表達(dá)載體pSecTag2/CD13/AGAP，并在293T細(xì)胞中成功表達(dá)并純化融合蛋白. （2）融合蛋白對(duì)CD13陽性的腫瘤細(xì)胞NB4有特異結(jié)合作用，結(jié)合了AGAP的CD13單鏈抗體融合蛋