層粘連蛋白受體在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)及PI3-K信號通路與其表達(dá)的關(guān)系.pdf

1、背景： 人多發(fā)性骨髓瘤是一種常見的嚴(yán)重危害人類健康的造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，以異常漿細(xì)胞的惡性增殖為特點。盡管近年來多發(fā)性骨髓瘤的基礎(chǔ)研究和臨床研究取得了長足的進(jìn)展，但是目前為止，多發(fā)性骨髓瘤還是一種不能治愈的血液系統(tǒng)的惡性的疾病。因此有必要探索新的多發(fā)性骨髓瘤的治療策略。 67KD層粘連蛋白受體是非整合素家族的層粘連蛋白的高親和力受體，近年來的一些實驗研究發(fā)現(xiàn)，67KD層粘連蛋白受體在許多惡性腫瘤中異常表達(dá)，并且與腫瘤的浸

2、潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而且發(fā)現(xiàn)在一系列生長因子和細(xì)胞因子激發(fā)的信號傳導(dǎo)中，P13-K信號通路被證明參與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。 有研究表明67KD層粘連蛋白受體在多種惡性腫瘤細(xì)胞如卵巢癌、肺癌、髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中表達(dá)增多，但在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)未見報道。為此我們用RT-PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等手段和方法探討了67KD層粘連蛋白受體在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株及正常造血細(xì)胞中的表達(dá)，并研究了PI3-K信號通路與67KD層粘連蛋白受體表

3、達(dá)的關(guān)系。 實驗材料和方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)(1)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)：U266、RPMI8226、KM3細(xì)胞株。(2)正常人造血細(xì)胞培養(yǎng)：正常人外周血單個核細(xì)胞來自健康志愿者和浙江省血液中心成分輸血全血細(xì)胞分離后的殘留，正常人骨髓單個核細(xì)胞來自非腫瘤病人的股骨。 2.單個核細(xì)胞分離：Ficoll-Hypaque密度梯度離心法。 3.層粘連蛋白受體mRNA水平表達(dá)：半定量RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增67KD LR

4、完整編碼區(qū)，以β-actin為內(nèi)對照。 4.層粘連蛋白受體蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位：采用間接免疫雙熒光染色法。 5.P13-K信號通路抑制劑對U266細(xì)胞株增殖抑制作用：采用MTT法。 6.P13-K信號通路抑制劑處理U266細(xì)胞株后層粘連蛋白受體mRNA的表達(dá)：采用半定量．RT-PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)對照。 7.P13-K信號通路抑制劑處理U266細(xì)胞株后層粘連蛋白受體蛋白的表達(dá)：采用流式細(xì)胞分

5、析技術(shù)。 結(jié)果： 從RT-PCR的結(jié)果可知，與正常造血細(xì)胞相比，67KD層粘連蛋白受體的mRNA在三株人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中均呈過度表達(dá)狀態(tài)。 間接免疫雙熒光的結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果基本一致，67KD層粘連蛋白受體的蛋白在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中均呈高表達(dá)狀態(tài)，并且主要分布于細(xì)胞的胞漿中。 應(yīng)用P13-K信號通路抑制劑LY-294002作用U266細(xì)胞株48h后，67KD層粘連蛋白受體mRNA的表達(dá)出現(xiàn)明

6、顯抑制。流式細(xì)胞分析術(shù)的結(jié)果也顯示LY-294002作用U266細(xì)胞株48h后，67KD層粘連蛋白受體蛋白的表達(dá)也降低。 結(jié)論： 1.層粘連蛋白受體在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中在核酸轉(zhuǎn)錄水平，蛋白水平呈高表達(dá)。 2.P13-K信號通路抑制劑LY-294002能夠明顯抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中層粘連蛋白受體的表達(dá)，提示層粘連蛋白受體與PI3-K信號通路存在相互關(guān)系。 3.P13-K信號通路抑制劑LY-294002能