調(diào)控PON1基因?qū)硵澄芳毙灾卸拘∈蟾螕p傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建含有PON1基因過(guò)表達(dá)的重組慢病毒載體，通過(guò)在Balb/c小鼠中構(gòu)建PON1過(guò)表達(dá)的動(dòng)物模型，驗(yàn)證PON1調(diào)控及在小鼠體內(nèi)的表達(dá)效果。觀察調(diào)控PON1基因?qū)硵澄芳毙灾卸竞笮∈蟾螕p傷氧化應(yīng)激水平和炎癥因子指標(biāo)的影響，探討調(diào)控PON1對(duì)敵敵畏急性中毒小鼠肝損傷的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.攜帶PON1基因的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠的驗(yàn)證
　　12只Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組4只:正常對(duì)照組、Lv-

2、GFP組、Lv-PON1組。將重組慢病毒載體經(jīng)尾靜脈轉(zhuǎn)染小鼠后，各自連續(xù)0d、1d、3d、5d、7d、9d經(jīng)眼底靜脈叢取血，檢測(cè)血清PON1活性水平，通過(guò)RT-PCR及Western blot技術(shù)驗(yàn)證PON1在肝組織中的表達(dá)。
　　2.攜帶PON1基因的慢病毒對(duì)敵敵畏中毒小鼠肝損傷的影響
　　(1).根據(jù)攜帶PON1基因慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠后的表達(dá)效果，選擇在慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠后的第3d對(duì)小鼠進(jìn)行敵敵畏染毒。96只Balb/c小鼠隨機(jī)

3、分為4組，每組24只:正常對(duì)照組、敵敵畏染毒組、Lv-GFP+敵敵畏組、Lv-PON1+敵敵畏組。將上述各組分為4個(gè)亞組，每亞組6只小鼠，分別于6h、12h、24h、48h麻醉處死留取標(biāo)本。
　　(2).觀察敵敵畏染毒后各組小鼠的行為變化及攜帶PON1基因慢病毒提前干預(yù)后對(duì)小鼠行為的影響，包括:呼吸、流淚、流涎、腹瀉、精神狀態(tài)等;光鏡下觀察肝組織的病理改變。
　　(3).化學(xué)比色法檢測(cè)血清AST、ALT和AChE活力變化和肝

4、組織MDA、GSH含量;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠肝組織SOD、CAT、TNF-α、IL-1β水平;RT-PCR法檢測(cè)肝組織PON1 mRNA和Nrf2mRNA表達(dá);Western blot法檢測(cè)PON1、NF-κBp65蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.攜帶PON1基因的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠的驗(yàn)證
　　攜帶PON1基因的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠后，其血清PON1活性在第1d開始緩慢升高，自第3d起維持較高的活性水平;正常對(duì)照

5、組和Lv-GFP組血清PON1活性一直處于相對(duì)低水平。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，Lv-PON1組小鼠肝組織PON1mRNA和PON1蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和Lv-GFP組。
　　2.攜帶PON1基因的慢病毒對(duì)敵敵畏中毒小鼠肝損傷的影響
　　(1).正常對(duì)照組小鼠呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)自如，未見(jiàn)異常。敵敵畏染毒組小鼠染毒后出現(xiàn)流涎，腹瀉，呼吸急促，步態(tài)不穩(wěn)，肌肉震顫，精神萎靡，蜷縮成團(tuán)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其中毒癥

6、狀逐漸緩解;攜帶PON1基因慢病毒提前干預(yù)后，小鼠的中毒癥狀較敵敵畏染毒組有所減輕。光鏡下，小鼠在敵敵畏中毒后12h肝組織損傷變化最為顯著，攜帶PON1基因慢病毒提前干預(yù)后小鼠肝損傷有所減輕。
　　(2).與正常對(duì)照組相比，敵敵畏染毒組各時(shí)間點(diǎn)肝組織PON1 mRNA和PON1蛋白的表達(dá)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與敵敵畏染毒組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Lv-PON1+敵敵畏組肝組織PON1 mRNA和PON1蛋白表達(dá)均

7、明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　(3).與正常對(duì)照組相比，敵敵畏染毒組在染毒后6h、12h、24h血清AChE活力明顯受到抑制(P＜0.05）及6h、12h、24h、48h ALT、AST活力均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;與敵敵畏染毒組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Lv-PON1+敵敵畏組的血清AChE活力抑制程度明顯減輕(P＜0.05)，ALT、AST活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Lv-G

8、FP+敵敵畏組的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　(4).與正常對(duì)照組相比，敵敵畏染毒組在染毒后6h、12h、24h小鼠肝組織SOD活力及6h、12h、24h CAT活力和GSH含量均明顯降低(P＜0.05），6h、12h、24h、48h小鼠肝組織MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，6h、12h肝組織Nrf2mRNA表達(dá)略有下降，隨時(shí)間延長(zhǎng)Nrf2mRNA表達(dá)逐漸升高(P＜0.05);與敵敵畏染毒組相比

9、，Lv-PON1+敵敵畏組在6h、12h、24h、48h SOD活力、GSH含量明顯升高及6h、12h、24h CAT活力明顯升高(P＜0.05)，6h、12h、24h、48h MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Nrf2mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，Lv-GFP+敵敵畏組的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　(5).與正常對(duì)照組相比，敵敵畏染毒組6h、12h、24h、48h小鼠肝組織NF-κBp

10、65表達(dá)水平和TNF-α、IL-1β水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與敵敵畏染毒組相比，Lv-PON1+敵敵畏組在6h、12h、24h、48h小鼠肝組織TNF-α水平的升高程度均有所下降，6h、12h、24h IL-1β水平和NF-κBp65表達(dá)也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，48h IL-1β和NF-κBp65無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，Lv-GFP+敵敵畏組的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。