葡寡糖的衍生化及吸收研究.pdf

1、目的：
　　糖類是自然界中廣泛分布的一類重要的有機(jī)化合物，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，與免疫、炎癥、腫瘤等密切相關(guān)。糖類結(jié)構(gòu)復(fù)雜，既無紫外吸收又無熒光特性，檢測非常困難，極大地限制了糖類物質(zhì)的研究與進(jìn)展，因此糖類物質(zhì)的藥代動力學(xué)研究一直難有突破。盡管如此，目前已有多種口服糖類藥物面市，但是多糖類藥物口服能否吸收研究，仍然在爭論之中，主要因?yàn)檠芯糠椒ㄈ詫⒍嗵墙到鉃閱翁牵鴽]有考慮多糖的特性。本研究擬通過將寡糖衍生化，探討寡糖以原型吸收入血的

2、特點(diǎn)，為糖類的藥代動力學(xué)研究提供技術(shù)方法。
　　方法：
　　1．采用三種紫外衍生化試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和對氨基苯甲酸乙酯(ABEE)對葡寡糖混合物(maltodextrin)中聚合度1～10的單糖和寡糖進(jìn)行定量標(biāo)記，激光解析電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析標(biāo)記配比。同時采用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記maltodextrin，以熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度。
　　

3、2．建立在體單向腸灌流和體外Caco-2單層細(xì)胞模型中衍生化葡寡糖含量的HPLC檢測方法，選取三種標(biāo)記物中方法簡便、穩(wěn)定性、重復(fù)性相對較優(yōu)者，并對其色譜條件進(jìn)行方法學(xué)考察。
　　3．采用在體單向腸灌流以及體外Caco-2單層細(xì)胞模型，觀察maltodextrin衍生化產(chǎn)物的定量吸收特性。
　　結(jié)果：
　　1．獲得了PMP、AEC、ABEE以及FITC標(biāo)記的maltodextrin。ESI-MS分析顯示PMP、AEC、A

4、BEE三種衍生化試劑均可與maltodextrin中聚合度1～10的單糖和寡糖反應(yīng)，三者與糖分子分別以2：1、1：1和1：1比例定量結(jié)合。FITC標(biāo)記的maltodextrin經(jīng)熒光分光光度計(jì)檢測，靈敏度高，但是無法確定FITC標(biāo)記糖分子的比例關(guān)系，熒光分光光度計(jì)法也不能分離不同聚合度的寡糖，故不適用于本研究后續(xù)體內(nèi)、外吸收實(shí)驗(yàn)。
　　2．采用HPLC對三種紫外衍生化試劑標(biāo)記的maltodextrin進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，malto

5、dextrin的PMP衍生化物(PM)分離效果好，靈敏度高，穩(wěn)定性良好。其色譜條件為，色譜柱：250×4.60mm，5μmphenomenexC18；流動相：100mMNaAc/乙腈(梯度)；流速：1.0mL·min-1；紫外檢測波長245nm；進(jìn)樣量：20μL。Maltodextrin的AEC、ABEE衍生化產(chǎn)物，與PMP衍生化物相比較，色譜條件復(fù)雜、耗時長，且分離效果不及后者，因此采用maltodextrin的PMP衍生物進(jìn)行體內(nèi)、

6、外吸收研究。
　　3．在體腸灌流模型表明，灌流給予1mg·mL-1maltodextrin的PMP衍生化物后，經(jīng)30min左右可檢測到單糖、雙糖和三糖吸收入血。流出液中雙糖濃度出現(xiàn)升高的時間與血中雙糖濃度達(dá)最大值所對應(yīng)的時間大體一致，而流出液中其他聚合度糖濃度均呈下降趨勢。流出液中雙糖濃度的升高，提示聚合度較高的寡糖可能在腸道被降解后吸收入血。體外實(shí)驗(yàn)表明，Caco-2單層細(xì)胞對寡糖具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能，檢測到六種聚合度的糖可透過細(xì)胞層，