利用RNA干擾技術(shù)抑制人大腸癌細(xì)胞系RKO葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測GRP78在結(jié)直腸癌組織、腺瘤組織及正常粘膜組織中的表達(dá)情況，探討其在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的意義；觀察靶向shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體( PGPU6/GFP/Neo-GRP78)對人大腸癌細(xì)胞系GRP78 mRNA及蛋白的抑制作用。 方法：(1)采用免疫組織化學(xué)及RT-PCR檢測GRP78在結(jié)直腸癌組織、腺瘤組織及正常粘膜組織中的表達(dá)。(2)使用脂質(zhì)體2000將GRP78靶向shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(PGPU6/GFP/Neo-

2、GRP78)轉(zhuǎn)入人大腸癌細(xì)胞系RKO內(nèi)，通過RT-PCR和Western-blot，分別在mRNA和蛋白水平上，檢測轉(zhuǎn)染前后GRP78在RKO細(xì)胞系中的表達(dá)變化。 結(jié)果：(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織GRP78蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常粘膜組織(P<0.05)；腺瘤組織中GRP78蛋白的表達(dá)水平高于正常粘膜組織而低于癌組織(P<0.05)；在結(jié)直腸癌組織中未發(fā)現(xiàn)性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素與GRP78蛋白的表

3、達(dá)有關(guān)(P>0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：正常粘膜、腺瘤和腺癌組織中GRP78mRNA的表達(dá)無明顯差別(P>0.05)。(2)將靶向shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體( PGPU6/GFP/Neo-GRP78)轉(zhuǎn)入大腸癌細(xì)胞系RKO后，以G3PDH的表達(dá)做為內(nèi)對照，RT-PCR結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染前相比，轉(zhuǎn)染PGPU6/GFP/Neo-GRP78后GRP78mRNA的相對表達(dá)水平有顯著性差異(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h，隨著時間延

4、長，其在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)逐漸降低(P<0.05)；且轉(zhuǎn)染后48h表達(dá)水平趨于穩(wěn)定，與72h相比，無顯著性差異(P>0.05)。陰性對照組與轉(zhuǎn)染前相比，GRP78mRNA的相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。(3)將靶向shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體( PGPU6/GFP/Neo-GRP78)轉(zhuǎn)入大腸癌細(xì)胞系RKO后，以β-actin的表達(dá)做為內(nèi)對照，Western-blot結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染前相比，轉(zhuǎn)染GPU6/GFP/Neo-GRP78后GR

5、P78蛋白的相對表達(dá)水平有顯著性差異(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h，隨著時間延長，其在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)逐漸降低(P<0.05)；且轉(zhuǎn)染后72h表達(dá)水平趨于穩(wěn)定，與96h相比，無顯著性差異(P>0.05)；陰性對照組與轉(zhuǎn)染前相比，GRP78蛋白的相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：(1) GRP78在正常結(jié)直腸粘膜組織、腺瘤組織、腺癌組織中的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢，參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生過程。但是在mRNA水