人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)元樣分化中自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.在實(shí)驗(yàn)室中分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其生長(zhǎng)。
　　2.利用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及上皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,觀察神經(jīng)元樣分化中細(xì)胞形態(tài)等一系列變化。
　　3.初步檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過(guò)程中自噬相關(guān)基因表達(dá)的變化,探討該基因及其相關(guān)意義。
　　方法:
　　1.在患者知情條件下抽取骨髓,以肝素抗凝,以Ficoll-Paque密度梯度離心法(無(wú)菌通

2、風(fēng)柜內(nèi)操作)來(lái)獲得人單個(gè)核細(xì)胞,倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后,以1.0×106/L的細(xì)胞濃度接種于6孔板,72 h換液1次并去除未貼壁細(xì)胞,直到貼壁細(xì)胞的融合率大于80％時(shí)傳代培養(yǎng),傳代比例為1∶2。2.傳代培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后,接種到預(yù)鋪多聚賴氨酸的玻片上。等到細(xì)胞融合率大于50%時(shí),采用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子開(kāi)始預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)元樣分化的進(jìn)行。
　　3.利用表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,觀察其形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況

3、。
　　4.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶等表達(dá),采用Western blot初步檢測(cè)誘導(dǎo)前后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬相關(guān)基因 Beclin-1表達(dá)的變化。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以于體外培養(yǎng)存活一定時(shí)間,并可以于體外環(huán)境中接受一定程度的預(yù)處理。
　　2.經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈典型神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性率為78.7%。
　　3.誘導(dǎo)0.5 h