尿道下裂相關(guān)基因變異的研究.pdf

1、尿道下裂是一種常見的先天性的男性泌尿生殖系統(tǒng)畸形，表現(xiàn)為因尿道發(fā)育異常而致尿道開口達(dá)不到正常位置。自20世紀(jì)后期開始，尿道下裂的患病率在全球呈現(xiàn)不明原因的上升趨勢。根據(jù)歐洲及美國的流行病調(diào)查資料，男性新生兒患病率約為0.3％-0.8％，且在20世紀(jì)70年代到90年代期間，尿道下裂患病率增加了近1倍。在中國，1993-2000年中國部分地區(qū)男性圍生兒尿道下裂的患病率較部分發(fā)達(dá)國家低，但是在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的南方地區(qū)和城市也比較高，且在浙江省呈

2、上升趨勢。另有研究以醫(yī)院為基礎(chǔ)的監(jiān)測方法收集資料，探討1987～2001年間我國圍生兒尿道下裂發(fā)生率的變化趨勢，也發(fā)現(xiàn)中國圍生兒尿道下裂發(fā)生率有上升趨勢。綜上，各國基于人口以及醫(yī)院病案記錄的流行病學(xué)研究結(jié)果均顯示尿道下裂患病率有增加趨勢，因此進(jìn)一步研究其可能的原因有深刻意義。
　　 尿道下裂是一種病因復(fù)雜的疾病，大部分患兒尤其是癥狀較輕者病因不明。內(nèi)分泌和環(huán)境因素都參與疾病發(fā)生過程，更多調(diào)查表明其強(qiáng)烈的遺傳傾向。尿道下裂患者有明

3、顯的家族聚集傾向，多種涉及雄激素信號通路的酶參與尿道形成過程，編碼、調(diào)控這些酶的相應(yīng)基因的變化都可能影響疾病的發(fā)生發(fā)展，如雄激素受體(AR)、5α-還原酶(SRD5A2)、ATF3和FGF8/10等。
　　 同時(shí)，在泌尿生殖系統(tǒng)器官發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期發(fā)揮作用的基因都可能是尿道下裂的候選致病基因。研究表明MID1基因的突變可能導(dǎo)致X-連鎖形式的Opitz G/BBB綜合征，包括多種先天發(fā)育異常，如眼距過寬、唇裂/腭裂、氣管食道畸形、心

4、臟缺陷和尿道下裂等中線結(jié)構(gòu)缺陷。在脊椎動(dòng)物中，MID1蛋白具有高度保守性。對小鼠和雞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，在Opitz綜合征畸形所涉及器官中，MID1表達(dá)水平很高。利用人類胚胎進(jìn)行原位雜交的一項(xiàng)研究指出，相應(yīng)生殖結(jié)節(jié)處也有MID1表達(dá)。Opitz綜合征病例中攜帶MID1突變的患兒，85％有尿道下裂，因此MID1基因可能是部分尿道下裂的致病基因。
　　 SMAD4基因位于18q21.1，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物Smad4，包含552個(gè)氨基酸，與細(xì)胞

5、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，對TGF超家族有調(diào)節(jié)作用。TGF-β通過抑制ID1(inhibitor of DNAbinding1)表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分化。在有TGF-β信號情況下，Smad4或Smad3(同屬于Smad蛋白家族)與ATF-3結(jié)合，從細(xì)胞質(zhì)一起轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核的ATF-3與ID1啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其生物效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞分化。小鼠缺乏Smad3時(shí)，內(nèi)源性雌激素下降。這些提示Smad蛋白變化可能引起性激素作用失衡。前期連鎖不平

6、衡分析結(jié)果顯示，來自中東地區(qū)的尿道下裂病例中，18q21可能是候選基因所在區(qū)域。同時(shí)我們使用生物信息工具ENDEAVOUR識別候選基因，結(jié)果所列基因中SMAD4位次最高，因此SMAD4基因可能與尿道下裂發(fā)生有關(guān)。
　　 迄今為止，尿道下裂的病因假說主要集中在對激素的干擾上。內(nèi)分泌相關(guān)基因多態(tài)性與尿道下裂相關(guān)性的研究已經(jīng)很多。但是過去相關(guān)性研究通常樣本量較小，其結(jié)果在較大樣本的研究中重復(fù)性差。隨著單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片的發(fā)展

7、，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已成為用于闡明常見復(fù)雜疾病遺傳基礎(chǔ)的可行研究方法。大樣本資料往往用于檢測那些輕微增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的遺傳因素的研究，而單個(gè)基因分型檢測成本非常昂貴。一個(gè)實(shí)際的解決方案是使用DNA樣本庫，其可行性和準(zhǔn)確性已經(jīng)得到多項(xiàng)研究證實(shí)。
　　 為了確定尿道下裂易感性相關(guān)的遺傳變異，我們利用尿道下裂患者DNA標(biāo)本庫進(jìn)行GWAS研究，排除質(zhì)量控制檢查失敗的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)之后，選出關(guān)聯(lián)度最強(qiáng)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。其中7個(gè)

8、SNPs位于X染色體編碼基因二脂酰甘油激酶K(DGKK)。位于該基因內(nèi)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)都具有非常顯著連鎖不平衡性。但是其結(jié)果需要在其他人群中進(jìn)一步進(jìn)行基因檢測以證實(shí)。
　　 基于上述原因，本研究對新的候選基因MID1、SMAD4，以及選取的位于DGKK等多個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，與尿道下裂疾病的相關(guān)性進(jìn)行了研究。
　　 第一部分 MID1基因與尿道下裂相關(guān)性的研究
　　 目的：
　　 探討先天性尿道下

9、裂患者M(jìn)ID1基因突變情況以及多態(tài)位點(diǎn)基因型與尿道下裂發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 從瑞典收集的114例先天性尿道下裂患者和95例健康者作為初步基因掃描的研究對象。利用研究對象的外周血、手術(shù)中獲得的陰莖皮膚組織或胎盤組織提取DNA；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增MID1基因外顯子編碼區(qū)及其側(cè)翼序列；產(chǎn)物純化后，用BigDye()Terminator v3.1試劑盒，分別利用正向和反向引物對相應(yīng)片段進(jìn)行測序，然后在AB

10、13730全自動(dòng)測序儀上進(jìn)行掃描，用Seqscaoe2.5軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，與數(shù)據(jù)庫中基因的序列進(jìn)行比對，并與健康對照組比較，觀察基因突變情況。利用在線軟件HomoloGene分析同源氨基酸序列，用Alamut軟件預(yù)測基因突變對剪切位點(diǎn)以及氨基酸序列的影響。
　　 對單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs16986145基因型在病例組和對照組中的分布情況進(jìn)行研究。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，選取了378例尿道下裂患者和759例健康志愿者作為研究對象，采用

11、Taqman探針識別檢測基因型；用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1，對114個(gè)散發(fā)性尿道下裂患者和95個(gè)健康對照進(jìn)行直接測序，發(fā)現(xiàn)一例無義突變c.712G>T(p.E238X)，一例錯(cuò)義突變c.1679A>G(p.K560R)，和另外兩處同義突變，分別為5例c.1230G>A(p.S410S)和1例c.1284T>G(p.V428V)。而健康對照組中發(fā)現(xiàn)3例c.1230G>A(p.S410S)，均為女性，

12、未發(fā)現(xiàn)其他MID1基因突變。
　　 2，錯(cuò)義突變c.1679A>G(p.K560R)和同義突變c.1284T>G(p.V428V)為新發(fā)現(xiàn)的核苷酸變異。
　　 3，對378例尿道下裂患者和759例健康對照的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)c.1230G>A基因型測定結(jié)果表明，尿道下裂病例中稀有等位基因c.1230A頻率比健康對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9=0.016)。
　　 4，同源性分析顯示無義突變c.712G>T(p.E2

13、38X)，和同義突變c.1230G>A(p.S410S)和c.1284T>G(p.V428V)均位于氨基酸序列高度保守區(qū)，而錯(cuò)義突變c.1679A>G(p.K560R)位于氨基酸序列相對保守區(qū)。
　　 結(jié)論：
　　 研究結(jié)果表明在所研究的人群中，部分尿道下裂可能由MID1基因突變引起；MID1基因SNP rs16986145與尿道下裂的發(fā)病相關(guān)，MID1基因的rs16986145位點(diǎn)的基因型多態(tài)性可能是尿道下裂的致病因素

14、之一。
　　 第二部分瑞典人群中DGKK等基因單核苷酸多態(tài)性與尿道下裂相關(guān)性的研究
　　 目的：
　　 前期的全基因組多態(tài)性位點(diǎn)掃描研究發(fā)現(xiàn)，位于DGKK基因區(qū)域的多個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn)與尿道下裂疾病有關(guān)，連鎖不平衡性非常顯著，在此基礎(chǔ)上，選取DGKK基因內(nèi)含子中用于遺傳標(biāo)記的SNP(rs1934179)，及位于5’端上游區(qū)域中的可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用SNV(rs7063116)；同時(shí)選取了位于其他基因的8個(gè)S

15、NP，這些SNP位點(diǎn)在GWAS研究中也呈現(xiàn)與尿道下裂的相關(guān)性，包括rs1880386(GRID1)，rs6607499(KIAA2022)，rs12660161(MTHFD1L)，rs4705372(PPARGC1B)，ts1022357(SLC03A1)，rs10184015(SOS1)，rs3755071(SRBD1)，rs16985967(TTC28)，在源于瑞典人群的樣本中進(jìn)行基因型測定，以進(jìn)一步驗(yàn)證前期的研究結(jié)果。
　　

16、 方法：
　　 采用病例-對照的研究方法。選取源于瑞典人群的尿道下裂患者353例(Ⅰ、Ⅱ度尿道下裂266例，Ⅲ度尿道下裂62例)和健康對照402例，對收集的血液標(biāo)本或手術(shù)獲取的組織標(biāo)本進(jìn)行DNA提取。針對已經(jīng)篩選出的SNP應(yīng)用TAQMAN探針法進(jìn)行批量PCR擴(kuò)增，測定病例組和對照組的基因型分布。用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 研究結(jié)果表明，在尿道下裂病例組中DGKK基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs193

17、4179和ts7063116稀有等位基因分布頻率均顯著高于健康對照組，rs1934179和rs7063116稀有等位基因攜帶者患尿道下裂風(fēng)險(xiǎn)較高(rs1934179：OR=2.30，95％CI1.71-3.11，P=3.5×10-8和rs7063116：OR=2.03，95％CI1.50-2.75，P=3.4×10-6)。進(jìn)一步分層分析表明，Ⅰ、Ⅱ度尿道下裂病例組中，單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs1934179和rs7063116稀有等位基因分布

18、頻率均顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs1934179：OR=2.5，95％CI1.8-3.4，P=2.6×10-8和rs7063116：OR=2.2，95％CI1.6-3.0，P=2.7×10-6)。而Ⅲ度尿道下裂病例組中，rs1934179稀有等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)；rs7063116稀有等位基因頻率高于對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.067)。
　　 結(jié)論：
　　 在源

19、于瑞典人群的樣本中進(jìn)行的基因型測定，驗(yàn)證了DGKK基因中SNPrs1934179，及位于DGKK基因5’端上游區(qū)域中的SNP rs7063116，與尿道下裂的發(fā)病相關(guān)；并且進(jìn)一步分層分析顯示，rs1934179和rs7063116與Ⅰ、Ⅱ度尿道下裂相關(guān)性較強(qiáng)，而與Ⅲ度尿道下裂相關(guān)性較弱。
　　 第三部分 SMAD4基因與尿道下裂相關(guān)性的研究
　　 目的：
　　 探討先天性尿道下裂患者SMAD4基因突變情況與尿道下

20、裂發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 利用來自中東地區(qū)人群中的47例先天性尿道下裂患者作為初步基因掃描的研究對象。利用研究對象的外周血、手術(shù)中獲得的陰莖皮膚組織提取DNA；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增SMAD4基因外顯子編碼區(qū)及其側(cè)翼序列；產(chǎn)物純化后，用BigDye()Terminator v3.1試劑盒，分別利用正向和反向引物對相應(yīng)片段進(jìn)行測序，然后在ABI3730全自動(dòng)測序儀上進(jìn)行掃描，用Seqscape2.5軟件對

21、結(jié)果進(jìn)行分析，與數(shù)據(jù)庫中基因的序列進(jìn)行比對，觀察基因突變情況。利用在線軟件HomoloGene分析同源氨基酸序列，用Alamut軟件預(yù)測基因突變對剪切位點(diǎn)以及氨基酸序列的影響。
　　 結(jié)果：
　　 我們發(fā)現(xiàn)一例尿道下裂患者攜帶一同義突變，Exon10 c.1218G>A(Ala>Ala)，但未引起氨基酸序列改變，同時(shí)也未對剪切序列產(chǎn)生影響。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)研究所選的尿道下裂病例中，SMAD4基因