3％氯化鈉對(duì)脂多糖小鼠腦水腫的保護(hù)作用及非滲透機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　腦水腫是臨床常見(jiàn)危急重癥。由腦水腫所引起的顱內(nèi)高壓可引起腦血流的減少和繼發(fā)性缺血性腦損傷的發(fā)生，也可引起腦疝的形成而危及生命。高滲鈉溶液在臨床上已廣泛應(yīng)用于腦外傷、腦出血、腦梗塞所致腦水腫等的治療。目前常用的高滲鈉濃度有3％、5％、7.5％、10％、23.4％，大量臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了其療效.近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道，證實(shí)高滲鈉溶液治療腦水腫的療效優(yōu)于甘露醇，而且其副作用少。
　　高滲鈉治療腦水腫具體的機(jī)制尚不完

2、全清楚，其可能的機(jī)制有(1)滲透性作用;(2)增加局部腦組織灌注;(3)減輕腦損傷后的炎癥反應(yīng);(4)恢復(fù)細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶活性等。Zeng HK在大鼠缺血性腦損傷模型上發(fā)現(xiàn)10％氯化鈉可下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)的表達(dá)。本研究組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3％氯化鈉可下調(diào)兔大腸桿菌腦膜炎腦組織AQP4的表達(dá)。這提示3％氯化鈉可能通過(guò)下調(diào)AQP4的表達(dá)減輕腦水腫。脂多糖(lipopolysaccharide

3、，LPS)是大腸桿菌細(xì)胞壁上的主要成分，也是其主要的致病成分，與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步觀察3％氯化鈉對(duì)脂多糖所致腦水腫及腦組織炎癥因子、AQP4表達(dá)的影響，探討3％氯化鈉治療腦水腫的非滲透機(jī)制。
　　目的：
　　(1)觀察3％氯化鈉對(duì)脂多糖小鼠腦水腫及腦組織炎癥因子、AQP4表達(dá)的影響，探討3％氯化鈉治療脂多糖小鼠腦水腫的非滲透機(jī)制。
　　(2)在細(xì)胞水平探討蛋白激酶C(protein kinase C，P

4、KC)在3％氯化鈉下調(diào)AQP4表達(dá)中的作用。
　　1建立小鼠脂多糖腦水腫模型
　　1.1方法：
　　(1)觀察脂多糖對(duì)腦組織含水量變化的時(shí)效和量效作用:昆明小白鼠隨機(jī)分為2大組:對(duì)照組（control組）和脂多糖組(LPS組)，各組小鼠數(shù)見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10、20、40 mg/kg)，對(duì)照組小鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水，分別于脂多糖注射6、12小時(shí)后將小鼠處死，迅速取出大腦進(jìn)行含水量

5、測(cè)定。
　　(2)觀察脂多糖對(duì)腦組織免疫球蛋白G含量及細(xì)胞因子的影響:昆明小白鼠隨機(jī)分為2大組:對(duì)照組(control組)和脂多糖組(LPS組)，各組小鼠數(shù)見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組小鼠予以腹腔注射脂多糖10 mg/kg，對(duì)照組小鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水，分別于注射脂多糖8、12小時(shí)后將小鼠處死，迅速取出大腦進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。Real-time RT-PCR檢測(cè)腦組織白介素β(interleukin-1 beta，IL-1β)和腫

6、瘤壞死因子a(tumor necrosis factor alfa，TNF-a) mRNA含量，ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-a和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)蛋白含量。統(tǒng)計(jì)方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析， P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2結(jié)果：
　　(1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)6小時(shí)或12小時(shí)后

7、，各組腦組織含水量明顯增加，和對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，各脂多糖組間腦組織含水量無(wú)差異。
　　(2)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小時(shí)，腦組織含水量明顯增加，高于對(duì)照組(p＜0.05)，同時(shí)腦組織IgG含量增加，與對(duì)照組比較有明顯的差異(p＜0.05);注射脂多糖12小時(shí)后腦組織IgG含量也明顯增加，與對(duì)照組比較有明顯的差異(p＜0.05)，但與8小時(shí)組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　(3)腹腔注射脂

8、多糖(10mg/kg)8小時(shí)或12小時(shí)，腦組織中IL-1βmRNA及蛋白的含量明顯增高，與對(duì)照組相比均有顯著差異(p＜0.01，p＜0.05);脂多糖組間腦組織IL-1βmRNA及蛋白含量無(wú)差異;腦組織中TNF-αmRNA及蛋白含量的變化規(guī)律與IL-1β一致。
　　1.3結(jié)論：
　　(1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時(shí)后可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦水腫，增加脂多糖的作用時(shí)間延長(zhǎng)及劑量不再提高水腫的程度，表明腹腔注射脂多糖（10mg/

9、kg）6小時(shí)后可以成功誘導(dǎo)穩(wěn)定的脂多糖腦水腫模型。
　　(2)腹腔注射脂多糖所致腦水腫時(shí)血腦屏障通透性增高、腦組織細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)增加。
　　23％氯化鈉對(duì)脂多糖小鼠腦水腫的保護(hù)作用及可能機(jī)制
　　2.1方法：
　　昆明小白鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（control組），脂多糖組(LPS組)和3％氯化鈉組(HS組)，各組小鼠數(shù)目見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組和3％氯化鈉組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10m

10、g/kg)，對(duì)照組小鼠予以腹腔注射相同劑量的生理鹽水。于脂多糖注射后6小時(shí)，對(duì)照組和脂多糖組尾靜脈注射生理鹽水(20ml/kg)，3％氯化鈉組各尾靜脈注射3％氯化鈉(20ml/kg)，尾靜脈注射3％氯化鈉或生理鹽水2小時(shí)或6小時(shí)后處死小鼠，迅速斷頭，取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢查。測(cè)定腦組織含水量，Real-time RT-PCR檢測(cè)腦組織IL-1β、TNF-a、AQP-4 mRNA含量，ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-a和IgG蛋白含量，W

11、estern blotting檢測(cè)腦組織AQP-4蛋白含量。
　　統(tǒng)計(jì)方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析， P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2結(jié)果：
　　(1)3％氯化鈉組治療2小時(shí)后腦組織含水量明顯減少，低于脂多糖組(p＜0.05)，治療6小時(shí)后腦組織水含量仍然低于脂多糖組，但和2小時(shí)組無(wú)明顯差異。
　　(2)3％氯化鈉組治療2小時(shí)后腦組織IgG含量和脂多糖組無(wú)

12、明顯差異(p＞0.05);治療6小時(shí)后3％氯化鈉組腦組織IgG含量明顯降低(p＜0.05)，低于脂多糖組(p＜0.05)。
　　(3)3％氯化鈉組治療2小時(shí)后，腦組織中IL-1βmRNA明顯減低，與脂多糖組比較有明顯的差異(p＜0.01);腦組織中IL-1β蛋白含量雖有下降趨勢(shì)，但與脂多糖組比較無(wú)明顯的差異(p＞0.05)。3％氯化鈉組治療6小時(shí)后，腦組織中IL-1βmRNA進(jìn)一步減少(p＜0.01)，而IL-1β蛋白無(wú)進(jìn)一步減少

13、(p＞0.05)，但與脂多糖組比較均有明顯的差異(p＜0.01)。腦組織中TNF-αmRNA及蛋白含量的變化規(guī)律與IL-1β的一致。
　　(4)3％氯化鈉組治療2小時(shí)后，腦組織中AQP-4mRNA即明顯減低，與LPS組比較有明顯的差異(p＜0.01)，但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，腦組織中腦組織中AQP-4mRNA無(wú)進(jìn)一步下降現(xiàn)象，而腦組織AQP-4蛋白含量在治療2小時(shí)后雖與LPS組比較無(wú)明顯的差異(p＞0.05)。但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，腦組

14、織中AQP-4蛋白含量明顯減少(p＜0.05)，在3％氯化鈉組治療6小時(shí)后，腦組織中AQP-4蛋白與脂多糖組比較有明顯的差異(p＜0.05)。
　　2.3結(jié)論：
　　(1)3％氯化鈉可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫，下調(diào)腦水腫時(shí)腦組織炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生。
　　(2)3％氯化鈉可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫時(shí)腦組織AQP4的表達(dá)，減少炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生可能是3％氯化鈉抑制AQP4表達(dá)的機(jī)制之一。
　　3 PKC在3％

15、氯化鈉抑制AQP4表達(dá)中的作用
　　3.1方法：
　　(1)觀察3％氯化鈉對(duì)小鼠脂多糖腦水腫時(shí)腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCα含量的影響:昆明小白鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（control組），脂多糖組（LPS組）和3％氯化鈉組(HS組)，各組小鼠數(shù)目見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組和3％氯化鈉組小鼠予以腹腔注射脂多糖（10mg/kg），對(duì)照組小鼠予以腹腔注射相同劑量的生理鹽水。于脂多糖注射后6小時(shí)，對(duì)照組和脂多糖組尾靜脈注射生理鹽水(20m

16、l/kg)，3％氯化鈉組各尾靜脈注射3％氯化鈉(20ml/kg)，尾靜脈注射3％氯化鈉或生理鹽水2小時(shí)或6小時(shí)后處死小鼠，迅速斷頭，取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢查。Western blotting檢測(cè)腦組織腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量。
　　(2)觀察3％氯化鈉對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)的影響:
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)至第四代后，第四代星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為3大組:對(duì)照組（control組）、IL-1β組、IL-

17、1β+HS組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行相關(guān)檢查。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Real-time RT-PCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA含量，F(xiàn)CM(PE直接標(biāo)記抗體法)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面AQP-4含量。
　　(3)PKC抑制劑Calphostin C對(duì)3％氯化鈉誘導(dǎo)的AQP4表達(dá)變化的影響:第四代星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為6組:A.對(duì)照組（control組）;B.IL-1β組;C.IL-1β+HS組;D.IL-1β+抑制劑組;E.IL-

18、1β+抑制劑+HS組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行相關(guān)檢查。Real-time RT-PCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA含量，F(xiàn)CM(PE直接標(biāo)記抗體法)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面AQP-4含量。
　　統(tǒng)計(jì)方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析， P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2結(jié)果：
　　(1)IL-1β組及IL-1β+HS組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。<

19、br>　　(2)脂多糖組腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCα含量無(wú)明顯變化，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05);3％氯化鈉組治療后6小時(shí)，腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCα含量明顯增高，明顯高于脂多糖組及對(duì)照組(P＜0.05)。
　　(3)用含IL-1β（5ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)后，星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA及蛋白含量明顯增加，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p＜0.01)。
　　(4)IL-1β+HS組星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA含

20、量低于IL-1β組，與IL-1β組比較有顯著差異(p＜0.01);星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白含量變化規(guī)律與AQP4 mRNA一致。
　　(5)PKCa抑制劑+HS組星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA含量明顯高于IL-1β+HS組(p＜0.01)，但仍低于IL-1β組(p＜0.01);星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白含量變化規(guī)律與AQP4 mRNA一致。
　　3.3結(jié)論：
　　(1)3％氯化鈉可抑制IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA

21、和蛋白表達(dá)。
　　(2)3％氯化鈉可能通過(guò)激活PKC而抑制IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　(1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時(shí)后可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦水腫，成功建立了穩(wěn)定的脂多糖腦水腫模型;脂多糖所致腦水腫時(shí)血腦屏障通透性增高、腦組織細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)增加。
　　(2)3％氯化鈉可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫，下調(diào)腦水腫時(shí)腦組織炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生。