基質(zhì)金屬蛋白酶（MT1-MMP-MMP-2）及其組織抑制劑（TIMP-2）在人乳腺癌組織中表達(dá)的研究.pdf

1、目的:乳腺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，研究和探討乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，其中腫瘤周圍基底膜的降解是腫瘤細(xì)胞向鄰近結(jié)締組織浸潤(rùn)進(jìn)而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中最基本的一步，基底膜完整性的喪失與局部擴(kuò)散，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。而由腫瘤組織分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)能夠引起細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解

2、，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)其抑制因子可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而保持基底膜的完整性，阻止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在乳腺癌中的表達(dá)的情況和臨床意義以及它們生物學(xué)作用研究較少。因此，本課題利用免疫組化(IHC)和蛋白印跡(WB)兩種實(shí)驗(yàn)方法在蛋白水平上研究MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP在乳腺癌中的表達(dá)特點(diǎn)及與乳腺癌的臨床病理因子之間相互關(guān)系，以探討三者在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用，并可

3、為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法:選取2004年5月至2004年12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科行手術(shù)治療的64例乳腺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本(一部分以10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成實(shí)驗(yàn)標(biāo)本蠟塊備用)，同時(shí)收集30例乳腺良性腫瘤組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均于離體半小時(shí)內(nèi)采集，液氮速凍，后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱貯存待用，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，首先應(yīng)用免疫組化(Immunohistochemistry，

4、IHC)的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)事先制備好的64例乳腺癌組織標(biāo)本中MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表達(dá)情況，對(duì)于34例共同陽性表達(dá)的標(biāo)本應(yīng)用免疫組化圖像分析軟件進(jìn)行計(jì)量分析，然后采用蛋白印跡(WesternBlot)的實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)30例乳腺癌組織和30例乳腺良性腫瘤組織中MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表達(dá)情況，結(jié)果分析以電泳條帶上各產(chǎn)物的面積與灰度值的乘積作為積分光密度值，作為乳腺癌中各產(chǎn)物的表達(dá)水平的參數(shù)。應(yīng)用SAS

5、6.12(StatisticalAnalysisSystemVersion6.12)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)類型，明確統(tǒng)計(jì)分析方法，采用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述(StatisticsDelineation)，正態(tài)性檢驗(yàn)(TestofNormality)，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(DataTransformation)，T檢驗(yàn)(Ttest)和單因素方差分析(AnalysisofVariance)等統(tǒng)計(jì)分析方法，編寫SAS代

6、碼，完成統(tǒng)計(jì)分析的自動(dòng)化，顯著檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取0.05。 結(jié)果:應(yīng)用免疫組組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)到MMP-2，TIMP-9和MT1-MMP在64例乳腺癌組織中共同陽性表達(dá)的為34例，圖形分析系統(tǒng)分析分別得出具體表達(dá)值分別為：3.11±0.74，2.86±0.65，3.06±0.88(數(shù)據(jù)經(jīng)過自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)。陽性表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕色顆粒狀彌散分布，細(xì)胞核陰性，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)少。乳腺癌組織中MT1-MMP，MMP-2和TIM

7、P-2的表達(dá)以乳腺癌臨床病理因子(T分期，N分期，TNM分期，ER，PR和C-erbB-2)分組分層后分析各組各層間是否存在差異，本實(shí)驗(yàn)回答是否定的，即各組間無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用蛋白印跡的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)到MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白在30例乳腺癌及良性乳腺腫瘤組織中均有表達(dá)，在乳腺癌組織及良性乳腺腫瘤組織中MT1-MMP蛋白的表達(dá)水平分別為90.50±27.71，23.70±9.35(t=-12.51，P＜0.0

8、01)；MMP-2蛋白的表達(dá)水平分別為140.23±+46.82，47.30±16.03(t=-9.35，P＜0.001)；TIMP-2蛋白的表達(dá)水平分別為67.57±37.10，10.40±7.44(t=-9.30，P＜0.001)，MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2分別在乳腺良惡性腫瘤組織中的表達(dá)存在著極顯著的差異。本研究也試圖探討在乳腺癌組織中，MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2三者之間蛋白表達(dá)的相關(guān)性，但由于樣本量較

9、小，不支持相關(guān)性分析，所以未能得出三者之間的相關(guān)性結(jié)論。本研究又通過采用蛋白印跡(WesternBlot)的方法，來觀察乳腺癌組織中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2的表達(dá)以乳腺癌臨床病理因子(T分期，N分期，TNM分期，ER，PR和C-cerbB-2)分組分層后分析各組各層間是否存在差異，本實(shí)驗(yàn)回答是否定的，即各組各層間無顯著性差異。但是，經(jīng)過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后采用各組間T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在TNM分期Ⅱ、Ⅲ期之間MMP-2蛋白表達(dá)分別

10、為：160.38±47.16，124.80±27.93(t=2.25，P=0.0356)；TIMP-2蛋白表達(dá)分別為：53.38±17.02，80.40±38.49(t=-2.27，P=0.0338)，即MMP-2和TIMP-2蛋白表達(dá)分別在TNM分期Ⅱ、Ⅲ期之間存在著顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此可見這是本實(shí)驗(yàn)蛋白印跡方法所得到的又一個(gè)發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論:綜上所述，本研究通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法提示乳腺癌中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-

11、2蛋白的表達(dá)與良性乳腺腫瘤組織的表達(dá)存在顯著差異。那么MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白的的聯(lián)合檢測(cè)可以提示乳腺癌的發(fā)病情況。在TNM分期Ⅱ，Ⅲ期之間MMP-2以及TIMP-2存在著顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即MMP-2和TIMP-2對(duì)于Ⅱ，Ⅲ期乳腺癌患者的腫瘤惡性行為以及在預(yù)后和治療方面都有提示和指導(dǎo)作用，反應(yīng)腫瘤有更高的惡性生物學(xué)行為以及可能成為乳腺癌不良預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。本研究還通過免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察到MT1-MMP，MMP-2和T