蝎毒素BmK IA調(diào)節(jié)T細胞活化增殖的研究.pdf

1、背景及目的：近年來興起的對蝎毒(Scorpion Venom)的研究是由于全蝎(scomion)作為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的動物性藥材已有很久歷史。在《本草綱目》、《本經(jīng)逢源》、《開寶本草》等經(jīng)典醫(yī)學(xué)叢書中都有對全蝎的記載。全蝎是一種傳統(tǒng)的中藥材，其性辛、平，味咸，有毒，歸肝經(jīng)；具有熄風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效；傳統(tǒng)驗方中主要用于治療小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、瘡瘍、瘰疬和癲癇。另外，祖國醫(yī)學(xué)認為腫瘤的根源是邪毒

2、瘀結(jié)、毒陷邪深，非攻不克，全蝎有攻堅蝕瘡、破瘀散結(jié)、消除腫塊的功效，因此也常用于惡性腫瘤的治療，且有很多現(xiàn)代研究證明全蝎可以殺傷腫瘤細胞提高肌體免疫力。古代也有蝎尾藥力尤甚的記載。 現(xiàn)代研究認為，蝎毒是一種成分復(fù)雜的混合物，由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成，其含有多種生物活性成分，其中研究最多的且已被證明有諸多生理活性的主要是其蛋白質(zhì)部分的蝎毒素，一般含30～70個氨基酸殘基及3～4對二硫鍵，分子量為7000左右。研究表明蝎毒素中存

3、在很多的活性成分，對東亞鉗蝎(ButhusMartensii Karsch)毒素的研究結(jié)果顯示，其粗毒除含有特異作用于Na<'+>通道及Ca<'+>通道的主要配體，還含有特異作用于K<'+>通道的配體。蝎毒素所具有的機體治療作用已經(jīng)被很多研究證實，臨床研究顯示蝎毒可用于抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、降血壓、抗驚厥、以及某些神經(jīng)性疾病的治療，且部分文獻資料研究顯示蝎毒素在起治療作用的同時可以提高機體免疫力，促進骨髓造血功能，減少其它使用藥物的副作用。我們

4、課題組通過凝膠過濾層析法(Gel-filtration Chromatography)分離提取了東亞鉗蝎蝎毒成分BmK IA(Buthus martensii Karsch Immunol Action)，并且通過離子交換葡聚糖凝膠柱層析法(Ion exchange Sephadex column Chromatography)從BmK IA中進一步分離得到五種純化蛋白成分蝎毒素BmK IA<,1>、BmK IA<,2>、BmK IA<

5、,3>、BmK IAt、BmK IA<,5>。本課題旨在通過細胞學(xué)的研究，探討蝎毒素體外調(diào)節(jié)免疫細胞，促使免疫細胞活化增殖的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過流式細胞儀(Flow Cytometry)檢測比較T細胞被作用前后兩組細胞亞群膜表面分子CD69的表達變化來進一步探討蝎毒素BmK IA調(diào)節(jié)T細胞活化增殖可能作用途徑，以及某些潛在的免疫特性。 方法：人類急性T淋巴細胞白血病細胞株JurkatE6-1用含10％FBS(Fetal Bovin

6、eserum)的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用MTT法觀察不同濃度梯度的蝎毒素BmKIA及五種純化成分蝎毒素BmK IA<,1>、BmK IA<,2>、BmK IA<,3>、BmK IA<,4>、BmK IA<,5>對JurkatE6-1細胞增殖作用的劑量效應(yīng)關(guān)系；采用流式細胞術(shù)(Flow Cytometry Method，F(xiàn)CM)檢測蝎毒素BmK IA對T淋巴細胞亞群CD4<'+>T細胞和CD8<'+>T細胞的膜表面活化表型分

7、子CD69表達情況。結(jié)果：(1)蝎毒素BmK IA對JurkatE6-1細胞的增殖作用隨濃度的遞增和細胞增殖率之間存在著一定的依賴關(guān)系；隨著蝎毒素BmK IA的工作濃度遞增JurkatE6-1的細胞增殖率達到90％，接著隨著蝎毒素BmK IA濃度的升高細胞增殖率開始逐漸下降。而JurkatE6-1細胞的增殖程度和五種純化成分間均具有明顯的濃度正相關(guān)關(guān)系，均具有隨著濃度的加大細胞增殖率逐漸增高。(2)蝎毒素BmK IA對促使人外周血中CD

8、4<'+>T細胞中代表細胞活化的膜表面活化標(biāo)志CD69分子的表達在12小時達到高峰24％，24小時已有下降。對CD8<'+>T細胞中代表細胞活化的膜表面分子CD69的表達在24小時可以達到95％。 結(jié)論：蝎毒素BmK IA對研究T淋巴細胞活化模型一人類急性T淋巴細胞白血病細胞株JurkatE6-1有較強的增殖作用，該增殖作用和濃度之間有著一定的量效關(guān)系。從蝎毒素BmK IA中進一步純化的五種成分蝎毒素BmK IA。、BmK IA

9、<,2>、BmK IA<,3>、BmK IA<,4>、BmK IA<,5>各自對JurkatE6-1細胞的促增殖作用程度均低于蝎毒素BmK IA，五種成分的作用和對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，且蝎毒素BmK IA在微量的工作濃度下就可以在12-24小時的時間內(nèi)促使人外周血中T細胞亞群的活化程度達到高峰，并且促使CD8<'+>T細胞活化的能力遠遠高于活化CD4<'+>T細胞?？偠灾舅谺mK IA可以促進T細胞的活化增殖，且在