BmK IA對C-,57-BL-6小鼠體內主要免疫細胞的活化作用.pdf

1、目的：現(xiàn)代醫(yī)學，細胞生物學及分子生物學的發(fā)展，使人們認識到免疫系統(tǒng)的紊亂不僅會產(chǎn)生多種疾病，而且與人體衰老及老年人的多發(fā)病如腫瘤，高血壓、糖尿病甚至精神病的發(fā)生均有密切關系。艾滋病(AIDS)的危害，使人們對免疫缺損的嚴重后果有了更深刻的認識，因此尋找具有良好免疫調節(jié)作用的藥物已成為當代新藥的發(fā)展方向之一。對中草藥免疫學研究已有數(shù)十年的歷史，前階段的研究多以中草藥對免疫指標的增強或抑制為準繩，確定其對免疫功能的效應。近年來人們越來越認識

2、到，探討中草藥在機體內發(fā)揮作用的部位及其對機體免疫網(wǎng)絡影響的重要性。 蝎毒素的藥用研究是由于全蝎作為傳統(tǒng)的動物性中藥材在我國已有上千年歷史。在《本草綱目》、《本經(jīng)逢源》、《開寶本草》及《醫(yī)林篡要》等傳統(tǒng)醫(yī)學經(jīng)典中記載，全蝎有活血化淤、攻毒散結、趨風止痛等功效。近年來對全蝎藥理作用的研究已確認其藥效成分集中在蝎毒中，并在其藥理、藥效學研究方面取得了很大進展。東亞鉗蝎(Buthus martcnsii Karsch,BmK)是廣泛分

3、布在我國中西部地區(qū)的蝎種，其蝎尾提取液蝎毒是一種毒性僅次于蛇毒的生物毒素(Buthus martcnsiiKarsch Immunc Active，Bmk IA)，因具有復雜的成分及性質而產(chǎn)生多種生理、藥理活性。蝎毒的抗腫瘤、抗風濕、抗癲癇以及對心血管病等方面的作用已被多位學者所證實，并有學者研究顯示，蝎毒在做輔助治療的同時具有增強機體免疫力、減少其它藥物毒副作用之功效，卻未見蝎毒作為免疫調節(jié)劑對機體發(fā)揮免疫調節(jié)作用的相關報道<'[42

4、,61]>。2005年國外報道在了解中毒病理機制時，發(fā)現(xiàn)蝎毒某組分(Titvus serrulatus scorpion vcnom,TSV)對小鼠巨噬細胞分泌(TNF-α、IL-1、IL-1β等)功能有調節(jié)作用，尤其組分Ⅱ(FⅡ)是巨噬細胞分泌TNF的強化因子；本課題組在前期的實驗中也發(fā)現(xiàn)：蝎毒分離組分Ⅲ(Scorpion venom crude,SVCⅢ)微小劑量下對體外培養(yǎng)的人類急性T淋巴細胞白血病細胞系JurakatE6-1細胞

5、的淋巴轉化有促進作用(JurakatcE6-1可作為研究T淋巴細胞活化條件的模型)，且對荷瘤小鼠體內α-腫瘤壞死因子(TNF-α)的產(chǎn)生有促進作用。以上結果提示：BmKIA可能是一種生物應答調節(jié)劑，并通過調節(jié)機體的細胞免疫功能來發(fā)揮抑殺腫瘤細胞作用。有學者對其生物及生化學研究顯示出蝎種屬的遺傳與毒素結構的同源性，而且蝎毒多肽的結構特征與一些細胞因子相像，大量的免疫細胞因子中含有類似的一級結構，(如趨化性細胞因子等)，BmK IA是否象某

6、些細胞因子一樣也對免疫細胞發(fā)揮激活或調節(jié)作用呢?Bmk IA是如何發(fā)揮免疫調節(jié)作用的，免疫作用靶點是什么，Bmk IA引起了什么樣的免疫網(wǎng)絡聯(lián)系等問題還無相關的明確解釋。 本研究通過小鼠體內實驗，運用現(xiàn)代分子生物學實驗技術，探討B(tài)mK IA在活體內對四類主要免疫細胞(單核、NK、T、B細胞)的活化作用，從不同免疫細胞活化時相了解藥物可能的作用靶細胞及活化動力學變化；進而探討不同用藥方式對BmK IA免疫活化作用的影響；為揭示Bm

7、k IA在免疫網(wǎng)絡中發(fā)揮調節(jié)作用機制建立理論基礎。 方法：1.經(jīng)小鼠尾靜脈一次性注射有效劑量BmK IA后，在不同時段(2h、8h、12h、24h)取外周血，用特異性熒光抗體分別標記外周血單核、NK、T、B細胞，采用流式細胞術，檢測四種主要免疫細胞共同活化標志CD69<'+>的表達率，繪制CD69<'+>表達的時效曲線，研究體內免疫細胞活化動力學變化，探明BmK IA作用的免疫細胞種類及其活化時段。2.采用尾靜脈注射和腹腔注射兩

8、種用藥方法，運用流式細胞術結合特異性免疫熒光標記法，觀察有效濃度BmK IA對小鼠外周血4種主要免疫細胞的免疫活化作用，進一步了解不同用藥方式對BmK IA發(fā)揮免疫調節(jié)作用的影響。 結果：1.靜脈注射1/60半數(shù)致死量的BmK IA溶液，分別在不同時段流式細胞儀檢測小鼠外周血5種免疫細胞CD69陽性率：各種細胞與其對照組比較均具顯著性差異(P<0.05)，以CD8<'+>T細胞最高，其次為NK細胞、B細胞和單核細胞，注射后2小時

9、開始升高，8小時達高峰，12小時開始下降。對CD4<'+>T細胞作用不明顯。2.采用腹腔和靜脈注射兩種不同用藥方式，流式細胞儀檢測小鼠外周血免疫細胞CD69陽性率，通過分析得出：兩種用藥方式BmK IA對CD8<'+>T細胞和B細胞均具活化作用，且效果相當；靜脈注射BmK IA對NK細胞活化作用較腹腔注射起效塊、活化率幅度高；腹腔注射BmK IA對單核細胞活化作用較靜脈注射起效快、活化率幅度高。 結論：1.有效濃度BmK IA，

10、對小鼠外周血5種免疫細胞均具有一定的活化作用，且具有一定時效性，作用強弱不同，以CD8<'+>T細胞為最強，其次為NK細胞、B細胞和單核細胞，CD4<'+>T細胞最弱，活化高峰在用藥后8小時。2.腹腔注射，BmK IA對小鼠體內主要免疫細胞同樣具有免疫活化作用；用藥方式不同對單核細胞和NK細胞的活化作用影響較大，靜脈用藥時NK細胞活化時相早、峰值高，腹腔用藥時單核細胞活化早、峰值高，而對T細胞和B細胞活化作用影響不明顯，但腹腔用藥時峰值