IVIG對(duì)C57BL-6小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的預(yù)防及治療作用研究.pdf

1、背景和目的：靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）應(yīng)用于臨床上已經(jīng)有四十多年的歷史，大劑量地注射IVIG目前在臨床上主要適用于治療原發(fā)性或繼發(fā)性的免疫缺陷疾病，其副作用極小，已經(jīng)被臨床證實(shí)為安全藥物。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤與自身免疫疾病常常共存在患者體內(nèi)，且有臨床研究發(fā)現(xiàn)IVIG在治療免疫缺陷疾病的同時(shí)，對(duì)共存在患者體內(nèi)的腫瘤也具有一定的抑制作用。有研究報(bào)道在黑色素瘤、肉瘤、直腸癌等腫瘤動(dòng)物模型中，腫瘤細(xì)胞系以及腫瘤患者身上應(yīng)用IVIG能夠

2、對(duì)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起到一定的抑制作用，但至今仍沒有系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)或報(bào)告。對(duì)于IVIG的作用機(jī)理已有很多研究，但關(guān)于IVIG抑制腫瘤的作用機(jī)制卻很少有報(bào)道，且至今仍沒有統(tǒng)一公認(rèn)的理論，Carmine等于2015年5月在Nature雜志上發(fā)表論文，認(rèn)為外源性IgG可能與腫瘤抗原結(jié)合，使樹突狀細(xì)胞能夠吞噬這些抗原，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞，殺滅腫瘤細(xì)胞。目前看來，IVIG很可能同時(shí)通過多種機(jī)制和通路發(fā)揮作用。本研究的目的在于研究小鼠IVIG對(duì)黑色素

3、瘤在C57BL/6小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的預(yù)防及治療作用，并且探討IVIG發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移作用的可能性機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1.材料：
　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7-8周齡C57BL/6雌鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。
　　1.2 細(xì)胞：小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10購自武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW246.7購

4、自上海歌凡生物科技有限公司，兩種細(xì)胞均培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：小鼠IgG干粉購自北京索萊寶科技有限公司，保存于-20℃冰箱中，現(xiàn)用現(xiàn)溶解；Cell Counting Kit CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，避光保存于4℃冰箱中；ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司，保存于4℃冰箱中；Mouse Cytokine

5、 Array Kit小鼠細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片購自美國R＆D公司，保存于4℃冰箱中。
　　2.銀染：將小鼠IgG干粉用PBS緩沖液溶解后，熱變性，SDS-PAGE電泳，再利用硝酸銀染色技術(shù)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行染色，以此鑒定小鼠IgG純度。
　　3.小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建：對(duì)C57BL/6小鼠尾靜脈注射B16F10黑色素瘤細(xì)胞，注射的細(xì)胞數(shù)量包括1.5×105，2.5×105,4×105。正常情況下15天左右腫瘤開始轉(zhuǎn)移到肺。通過

6、在接種腫瘤前后對(duì)小鼠給予尾靜脈注射小鼠IVIG來分別建立預(yù)防模型和治療模型。
　　4.生存期分析：對(duì)C57BL/6小鼠尾靜脈注射1.5×105個(gè)B16F10細(xì)胞，通過在接種腫瘤前后對(duì)小鼠給予尾靜脈注射小鼠IVIG來分別建立預(yù)防模型和治療模型，然后統(tǒng)計(jì)小鼠的累積生存率。
　　5.免疫組織化學(xué)染色：檢測黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠肺臟組織中g(shù)p100和ki67的表達(dá)，以此判斷IVIG對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移及其惡性程度的影響。
　　6.免疫

7、組化打分：對(duì)ki67抗體染色的小鼠肺組織切片，于400×鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)計(jì)算ki67的標(biāo)記指數(shù)（LI）即陽性率，作為判斷黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的惡性程度的標(biāo)準(zhǔn)之一。LI=(p/t)×100％(p：陽性細(xì)胞數(shù)，t：總細(xì)胞數(shù))。
　　7.細(xì)胞增殖活性檢測實(shí)驗(yàn)：用經(jīng)IVIG刺激過后的小鼠巨噬細(xì)胞上清液去刺激黑色素瘤細(xì)胞，再利用Cell Counting Kit CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒檢測黑色素瘤細(xì)胞的增殖活性。
　

8、　8.免疫酶聯(lián)分析實(shí)驗(yàn)（ELISA）：用不同濃度的IVIG去刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7，再利用ELISA方法檢測小鼠巨噬細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-12的水平，以此鑒定IVIG對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子分泌的影響。
　　9.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)：采用高通量的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，利用Mouse Cytokine Array Kit小鼠細(xì)胞因子蛋白芯片檢測IVIG對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子分泌的影響。
　　結(jié)果：
　　1.銀

9、染結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)中所用小鼠IVIG由重鏈和輕鏈組成，無明顯的其他蛋白條帶。
　　2.IVIG在預(yù)防實(shí)驗(yàn)鼠和治療實(shí)驗(yàn)鼠中明顯抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。
　　3.經(jīng)IVIG預(yù)防或治療的黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠生存期明顯延長。
　　4.經(jīng)IVIG預(yù)防或治療的小鼠肺組織中g(shù)p100和ki67陽性率明顯低于對(duì)照小鼠。
　　5.經(jīng)IVIG刺激的小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7上清明顯抑制B16細(xì)胞的增殖活性。
　　6.IVIG刺激小鼠

10、巨噬細(xì)胞RAW246.7分泌TNF-α、IL-6、IL-12、G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1ra、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、C5/C5a，同時(shí)抑制其分泌Eotaxin、IP-10、sICAM-1、IL-10。
　　結(jié)論：尾靜脈注射小鼠IVIG對(duì)黑色素瘤細(xì)胞在C57BL/6小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移具有預(yù)防和治療的作用，IVIG發(fā)揮該作用的機(jī)制可能是：IVIG刺激小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-12、