非對稱和對稱IVIG對小鼠黑色素瘤的預(yù)防和治療機制研究.pdf

1、目的：
　　免疫球蛋白G(IgG)是一類具有抗體活性可與對應(yīng)抗原特異性結(jié)合的一類球蛋白，而靜脈注射免疫球蛋白G(IVIG)其生產(chǎn)來源自至少1000名以上健康獻(xiàn)血志愿者，所得血漿進(jìn)行混合，分離，再提純而來的。所以說IVIG是一種具有抗體活性并且含有廣譜抗菌和抗病毒作用的IgG總和。Margni RA等課題組在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)在IgG分子中存在一種異常糖基化的IgG，這種免疫球蛋白在其Fab段的一端存在糖基，而另一端沒有，使得Ig

2、G分子不對稱，我們稱之為非對稱 IgG。這種非對稱IgG只能與抗原單價結(jié)合，其結(jié)合能力比對稱IgG弱百倍，并且不能引起下游有效的免疫效應(yīng)發(fā)生，如CDC、ADCC等。黑色素瘤又被稱為惡性黑色素瘤，其惡性性程度高，侵襲性強，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生早，是威脅患者生命健康的最主要因素。相關(guān)研究報道，IVIG在動物腫瘤轉(zhuǎn)移模型中對腫瘤在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移起到了明顯的抑制作用。但關(guān)于IVIG對腫瘤的預(yù)防是否有效及其在體內(nèi)IgG如何產(chǎn)生作用尚無確切報道。在本次研

3、究中，我們探索了IVIG和非對稱IgG對于小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的預(yù)防作用和對生存期的影響作用及其可能的作用機制。
　　方法：
　?、懦砷L至7到8周齡的C57BL/6雌鼠均訂購于北京市維通利華實驗動物公司，空運至汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院并飼養(yǎng)于汕大醫(yī)學(xué)院實驗動物中心的SPF級實驗動物房。⑵注射使用的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10均訂購于武漢Procell生命科技有限公司，培養(yǎng)于培養(yǎng)基為胎牛血清濃度為10％的DMEM培養(yǎng)基中，置于CO2濃度為

4、5%，溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。⑶訂購于北京索萊寶科技有限公司的小鼠干粉IgG，儲存于-20℃冰箱內(nèi)，用PBS溶液溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。人IVIG為上海萊士公司生產(chǎn)，儲存于4℃冰箱內(nèi)，用PBS稀釋，調(diào)PH至7.4。⑷將用PBS溶解稀釋后的IgG,反復(fù)經(jīng)過裝有rProteinG的親和層析柱，結(jié)合在層析柱上的即為純凈的總IgG。⑸將提純所得的總IgG熱變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用硝酸銀染色顯示電泳條帶，用來鑒定目的蛋白條帶的純度。⑹將

5、購買來的7到8周齡的C57BL/6雌鼠采用尾靜脈注射的方法注射1.5×105，2.0×105個B16F10細(xì)胞，一般腫瘤在第15天會形成肺轉(zhuǎn)移灶。利用該動物模型進(jìn)行預(yù)防實驗設(shè)計。⑺選取黑色素瘤的特異抗體ki67、gp100、mmp-2和mmp-9來對肺組織進(jìn)行免疫組化染色，并對其陽性率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，來判斷IVIG對小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的預(yù)防作用。⑻采用R&D公司的Mouse Cytokine Array Kit小鼠細(xì)胞因子蛋白芯片試劑盒

6、，對各組間分泌的炎性因子進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　①按照上述建模方法，小鼠的黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移成瘤率為100%。②經(jīng)銀染鑒定，本實驗中所用到的小鼠 IgG與人 IgG由兩條帶構(gòu)成且無明顯混雜蛋白條帶。③IVIG預(yù)防性注射可以有效的抑制小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。④對稱IgG對小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用較好于非對稱IgG對小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。⑤未進(jìn)行IVIG預(yù)防性注射的小鼠肺組織免疫組化顯示 ki67和 gp1

7、00的陽性率明顯高于預(yù)防組的小鼠。⑥預(yù)防性接種低劑量的IVIG可以有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖同時抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。⑦經(jīng)蛋白芯片檢測小鼠血漿內(nèi)的細(xì)胞因子，得出以下結(jié)論：IVIG可以刺激小鼠并促進(jìn)機體產(chǎn)生 BLC,IL-1ra；IVIG可以抑制小鼠機體產(chǎn)生IP-10,JE,KC,MIP-2,TIMP-1,TNF-a。
　　結(jié)論：
　　預(yù)防性注射IVIG可以有效的抑制黑色素瘤在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移，而IVIG起到預(yù)