晚期蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物在糖尿病大鼠腎臟損傷中的作用以及Apocynin的干預(yù)作用.pdf

1、糖尿病腎病已成為導(dǎo)致終末期腎功能不全的首要原因，嚴(yán)重影響了人類的生活質(zhì)量和壽命。盡管臨床研究已經(jīng)證實，血糖升高是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的重要危險因素，但有效地控制血糖并不能完全阻止糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。近年來氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展中的作用日益受到人們的重視。在與高血糖有關(guān)的多個生化過程中均伴隨著活性氧的生成，包括葡萄糖自氧化，多元醇途徑，前列腺素類的合成，蛋白質(zhì)的糖基化等等。晚期蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物(AOPPs)最早由Wi

2、tko-Sarsat等在尿毒癥患者的血漿中發(fā)現(xiàn)。將血漿或純化的人血清白蛋白在體外與次氯酸混合，產(chǎn)生AOPPs的濃度可隨次氯酸濃度增高呈劑量依賴性增加。Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者循環(huán)AOPPs水平均明顯升高，且Ⅱ型糖尿病患者的循環(huán)AOPPs水平明顯高于Ⅰ型糖尿病患者。Martin-Gallan等還發(fā)現(xiàn)，在有微血管并發(fā)癥的糖尿病患者，循環(huán)中AOPPs水平明顯高于無微血管并發(fā)癥的糖尿病患者。這些研究提示，AOPPs可能參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展

3、。AOPPs可引起中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)；刺激中性粒細(xì)胞合成白介素-8；刺激單核細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-a。血管內(nèi)皮細(xì)胞在AOPPs的刺激下可產(chǎn)生活性氧。AOPPs不僅是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，其本身也可能誘導(dǎo)或加重氧化應(yīng)激和炎癥。然而迄今為止，尚無關(guān)于AOPPs在糖尿病腎損害發(fā)病機制中作用的研究。 Apocynin是印度胡黃連根莖的一種提取物，中文譯名為夾竹桃麻素；加拿大麻素；香莢蘭乙酮等，可特異性抑制單核巨噬細(xì)胞還

4、原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活性。包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞在內(nèi)的吞噬細(xì)胞膜上有大量NADPH氧化酶，NADPH氧化酶的主要作用是在NADPH存在的條件下將單電子傳遞給O2形成超氧陰離子。NADPH氧化酶亦是許多非單核巨噬細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的重要來源。在生理狀態(tài)下，這些細(xì)胞的NADPH氧化酶活性很低，而各種生長因子、細(xì)胞因子、高血糖和

5、脂質(zhì)代謝障礙的刺激可使此酶激活，產(chǎn)生活性氧，作為信號傳遞分子或自由基的來源導(dǎo)致氧化損傷。在糖尿病患者和糖尿病動物模型中存在的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙均與NADPH氧化酶依賴的活性氧的過度生成有關(guān)，腎小球系膜細(xì)胞在高糖狀態(tài)下可導(dǎo)致NADPH氧化酶的激活并產(chǎn)生活性氧。NADPH氧化酶的激活在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起了十分重要的作用。apocynin可阻止NADPH氧化酶胞漿成分p47phox與膜上亞單位p67phox結(jié)合成膜復(fù)合物，從而抑制

6、NADPH氧化酶的激活。apocynin可減少巨噬細(xì)胞活化時前列腺素的合成和腎素的分泌，抑制炎癥反應(yīng)，因此可能是一種通過抑制氧化應(yīng)激達(dá)到抗炎癥效應(yīng)的活性因子。糖尿病大鼠給予apocynin治療可明顯減輕腎小球系膜增殖，降低尿蛋白排泄量。 本課題旨在證實下述假說：糖尿病時AOPPs潴留可能通過促進(jìn)腎臟的氧化應(yīng)激和炎癥加速腎臟損害，apocynin可能干預(yù)AOPPs的致腎損害作用。 材料和方法 體外制備AOPPs修飾

7、的大鼠白蛋白(AOPPs-RSA) 將純化的無內(nèi)毒素大鼠白蛋白(RSA)與次氯酸(HOCl)按照1∶140摩爾比混合，室溫孵育30min，用磷酸鹽(PBS)緩沖液4℃透析過夜，以碘試法檢測直至透析液中無HOCl。實驗中所有玻璃器皿均經(jīng)180℃烘烤4h去內(nèi)毒素處理。測定AOPPs濃度為5.3±0.4nmol/mg蛋白質(zhì)，對照樣本的AOPPs含量為0.3±0.04nmol/mg蛋白質(zhì)。 糖尿病模型的制備 雄性SD大鼠

8、(購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)體重220-240g，在恒溫清潔環(huán)境(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，禁食16小時后單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)55mg/kg(溶于0.01mol/L枸櫞酸緩沖液，PH4.5)，72小時用血糖儀剪尾測血糖＞16.7mmol/L作為糖尿病(DM)動物模型。 標(biāo)本留取和指標(biāo)檢測： 尿蛋白檢測應(yīng)用考馬斯亮蘭法。 腎皮質(zhì)勻漿和體外制備的AOPPs濃度檢測采用分光光度法。

9、 腎勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應(yīng)活性物質(zhì)(TBARS)檢測采用TBA顯色法。 血漿谷胱甘肽過氧化物酶活性(GPx)檢測采用DTNB顯色法。 尿轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)應(yīng)用商品化的ELASA試劑盒檢測。 腎組織病理觀察應(yīng)用過碘酸席夫氏(PAS)染色，免疫組化法標(biāo)記腎小球巨噬細(xì)胞特異性抗體ED-1陽性細(xì)胞。 組織總RNA的提取用Trizol提取法，反轉(zhuǎn)錄PCR半定量腎組織TGF-β1m

10、RNA的表達(dá)。 結(jié)果 (1)五組大鼠血糖和體重的變化： 糖尿病組大鼠血糖均高于正常對照組，證明糖尿病大鼠的模型是成功的。注射AOPPs以及apocynin治療對血糖無顯著影響。 糖尿病組大鼠體重均較對照組下降，AOPPs注射及apocynin治療對體重?zé)o顯著影響。 (2)注射AOPPs增加糖尿病大鼠尿蛋白排泄量： 糖尿病組大鼠24小時尿蛋白定量均高于正常對照組，而注射AOPPs使糖尿病大鼠

11、尿蛋白排出量顯著增加，apocynin治療則可顯著減輕AOPPs引起的尿蛋白排泄量增加)。 (3)注射AOPPs對糖尿病大鼠腎功能的影響： 糖尿病未治療組大鼠肌酐清除率均較正常對照組升高，AOPPs注射五周對糖尿病大鼠肌酐清除率無顯著影響，而apocynin治療可減輕糖尿病大鼠肌酐清除率的升高，治療組CCr與正常大鼠對照組相比差異無顯著性。 血肌酐五組之間無顯著差異。 (4)注射AOPPs對糖尿病大鼠血漿

12、白蛋白和血脂的影響： 糖尿病組血漿白蛋白均較正常對照組降低，注射AOPPs五周對糖尿病大鼠血漿白蛋白無顯著影響。而apocynin治療可減輕糖尿病大鼠血漿白蛋白的降低。 血膽固醇和甘油三酯五組之間未見顯著差異。 (5)注射AOPPs促進(jìn)糖尿病腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng) 四組糖尿病大鼠腎勻漿AOPPs均高于正常對照組，AOPPs注射可升高糖尿病大鼠腎勻漿AOPPs水平，apocynin治療可減輕注射AOPPs引起

13、的腎勻漿的AOPPs升高。 四組糖尿病大鼠腎勻漿TBARS水平均較正常對照組升高，AOPPs注射使糖尿病大鼠腎勻漿TBARS水平升高，apocynin治療可降低AOPPs注射和糖尿病引起的腎勻漿TBARS水平的升高。 與正常對照組相比，糖尿病大鼠注射生理鹽水和白蛋白組血漿GPx活性升高，糖尿病注射AOPPs組較注射生理鹽水和白蛋白組血漿GPx活性則顯著下降，apocynin治療可減輕注射AOPPs所引起的血漿GPx活性的

14、下降。 (6)注射AOPPs促進(jìn)糖尿病腎組織的早期炎癥反應(yīng) 四組糖尿病大鼠尿TGF-β1水平均高于正常對照組，AOPPs注射可升高尿TGF-β1排泄，apocynin治療則可減少注射AOPPs引起的尿TGF-β1的排泄。 RT-PCR半定量顯示四組糖尿病大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)均高于正常對照組，而注射AOPPs組又高于注射生理鹽水和白蛋白組，apocynin治療可減少AOPPs引起的腎組織TGF-β1m

15、RNA表達(dá)的增加 腎組織免疫組化染色顯示四組糖尿病大鼠腎小球ED-1陽性細(xì)胞數(shù)均較正常對照組升高，而注射AOPPs組又高于注射生理鹽水和白蛋白組，apocynin治療可減輕AOPPs引起的腎小球內(nèi)ED-1陽性細(xì)胞數(shù)的增加。 結(jié)論 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)，外源性給予AOPPs可加重糖尿病大鼠的蛋白尿，其機制可能與AOPPs增加了糖尿病大鼠腎臟局部的氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)有關(guān)。而apocynin