小檗堿對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用以及對(duì)大鼠腎臟AGEs-RAGE信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，觀察小檗堿(Berberine, BBR)對(duì)糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎臟生理病理和腎功能生化指標(biāo)的影響，明確BBR對(duì)DN大鼠的腎功能及組織病變的改善作用；檢測(cè)大鼠腎臟中部分組織細(xì)胞分泌的信號(hào)蛋白表達(dá)和相應(yīng)通路的調(diào)節(jié)變化以及由BBR給藥后影響的變化，探究BBR的腎臟保護(hù)作用是通過(guò)何種機(jī)制產(chǎn)生的。
　　在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)模擬DN條件刺激腎臟腎小球系膜細(xì)胞(Glome

2、rular mesangial cells, GMCs)和足細(xì)胞，進(jìn)而檢測(cè)系膜細(xì)胞中AGEs-RAGE(晚期糖基化終末產(chǎn)物，advanced glycation end products, AGEs;晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，receptor of advanced glycation end products, RAGE)信號(hào)通路的異常改變和足細(xì)胞與系膜細(xì)胞相互影響的信號(hào)通路VEGF-VEGFR2(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，vascular

3、 endothelial growth factor, VEGF;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ⅱ型受體，vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)的調(diào)節(jié)變化，同時(shí)觀察BBR給藥以及相應(yīng)刺激劑和阻斷劑給予后的影響作用，進(jìn)一步探討B(tài)BR對(duì)DN的腎臟保護(hù)作用以及潛在的分子機(jī)制和重要的分子靶點(diǎn)；為合理開(kāi)發(fā)利用BBR防治DN提供理論依據(jù)，并且為探索新的治療DN藥物開(kāi)拓新的研究方向和思路。

4、r>　　方法：DN大鼠模型的制備，采用長(zhǎng)周期（4-6周）高糖高脂飼料喂養(yǎng)并聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(STZ, streptozocin,35mg/kg)腹腔注射誘導(dǎo)。于72h后測(cè)量DN大鼠空腹血糖值(FBG, fasting blood-glucose)，將FBG≥11.1mmol/L的SD大鼠納入實(shí)驗(yàn)DN模型組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如下：正常組(Normal group)，DN模型組(DN model group), BBR低劑量組(50mg/k

5、g), BBR中劑量組(100mg/kg), BBR高劑量組(200mg/kg)，二甲雙胍組(200mg/kg)和卡托普利組(15mg/kg)，每組12只大鼠。正常組大鼠喂以正常飼料，模型組和給藥組繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。所有給藥組按大鼠體重計(jì)算給藥量，每日一次灌胃給藥(Intragastric administration, i. g)，正常組與模型組按體重給予相同溶劑羧甲基纖維素鈉溶液(Sodium carboxymet

6、hylcellulose, CMC-Na)平行對(duì)照灌胃。FBG值每倆周檢測(cè)一次，體重每周檢測(cè)一次，處死前一天收集24h尿樣用以檢測(cè)尿總蛋白(UTP, total urine protein)和尿肌酐(Ucr, urine creatinine)的含量；麻醉后股動(dòng)脈取血，分離血清檢測(cè)血尿素氮(BUN, blood urea nitrogen)，血肌酐(Scr, serum creatinine)和AGEs的含量。取同側(cè)腎臟稱重，制作組織切

7、片進(jìn)行腎臟病理學(xué)檢查，包括HE染色和PAS染色。免疫組化法觀察腎臟皮質(zhì)中AGEs，RAGE，TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子, transforming growth factor-β1)和PKC-β(蛋白激酶C-β，protein kinase C-β)的分布與表達(dá)；Western blot法檢測(cè)腎皮質(zhì)中各信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA, enzyme-linked immuno sorbent assay)法檢測(cè)各組血清

8、中AGEs的表達(dá)水平。
　　體外實(shí)驗(yàn)以腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞為研究對(duì)象，首先分離大鼠的系膜細(xì)胞和足細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，建立DN模型細(xì)胞系。利用CCK-8試劑盒檢測(cè)BBR對(duì)系膜細(xì)胞和足細(xì)胞DN狀態(tài)下的增殖影響。使用ELISA法檢測(cè)系膜細(xì)胞分泌AGEs的情況。對(duì)于AGEs-RAGE通路的蛋白，首先使用western blot法觀察正常情況，模型情況和不同濃度BBR給藥后以及使用AGEs刺激劑和RAGE阻斷劑（Ab-RAGE抗體

9、）后各信號(hào)蛋白的表達(dá)和變化情況；使用激光共聚焦法觀察RAGE蛋白分布，表達(dá)類(lèi)型和變化情況。對(duì)于VEGF-VEGFR2信號(hào)通路蛋白，首先使用蛋白芯片檢測(cè)DN狀態(tài)下足細(xì)胞分泌，確定關(guān)鍵因子；western bolt法驗(yàn)證VEGF，激光共聚焦法確定蛋白的分布和表達(dá)情況。CCK-8法確定VEGF對(duì)系膜細(xì)胞的適宜刺激濃度，用western bolt法觀察DN狀態(tài)，高糖，VEGF蛋白，足細(xì)胞上清液刺激和給藥情況下的VEGFR2的表達(dá)和磷酸化的表達(dá)；

10、激光共聚焦法檢測(cè)p-VEGFR2的分布和表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1. BBR對(duì)DN大鼠的體重和空腹血糖的影響
　　與正常組相比，造模成功后的DN大鼠的空腹血糖值顯著升高；各BBR治療組在前四周無(wú)明顯的降血糖效果，而在第6到8周中劑量和高劑量的BBR組與DN模型組相比具有明顯的降血糖作用；二甲雙胍組顯著性降低血糖作用從第四周開(kāi)始。對(duì)于體重，僅高劑量BBR組在第8周具有改善作用。
　　2. BBR對(duì)DN大鼠的腎功能及生化指標(biāo)

11、的影響
　　與正常組相比，DN模型組的腎重/體重比值，尿總蛋白/尿肌酐比值，血清尿素氮(BUN, blood urea nitrogen)和血肌酐(SCr, serum creatinine)含量均明顯升高。BBR中劑量組和高劑量組，以及陽(yáng)性藥二甲雙胍組和卡托普利組均能顯著改善腎功能和降低生化指標(biāo)。
　　3. BBR對(duì)DN大鼠的腎臟組織病理學(xué)的影響
　　組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的腎臟腎小球明顯肥

12、大，透明樣變化，基底膜明顯增厚，細(xì)胞外基質(zhì)聚集，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的腎小球硬化，纖維化以及伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DN大鼠在給予中劑量和高劑量的BBR的治療后，上述病理現(xiàn)象具有明顯改善；陽(yáng)性藥二甲雙胍組和卡托普利組也具有明顯的減輕病理表現(xiàn)作用。
　　4. BBR對(duì)DN大鼠腎臟皮質(zhì)組織中的AGEs、RAGE、p-PKC-β和TGF-β1蛋白的分布與表達(dá)的影響
　　免疫組化法顯示蛋白分布：在DN大鼠的腎組織中，AGEs彌散性的分布在整

13、個(gè)腎小球及其周?chē)?；RAGE主要分布在系膜細(xì)胞的胞膜上，少量分散在胞漿中；p-PKC-β在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有分布，但主要過(guò)表達(dá)集中于細(xì)胞質(zhì)中；TGF-β1主要位于細(xì)胞外液和細(xì)胞外基質(zhì)中。免疫組化法檢測(cè)蛋白表達(dá)：與正常組相比，DN模型組的大鼠腎臟中以上蛋白的表達(dá)顯著性的升高，而B(niǎo)BR給藥組中，低劑量BBR能夠有效的降低異常蛋白的表達(dá)，中劑量和高劑量的BBR則能夠更加明顯的改善和降低過(guò)高的含量。根據(jù)以上結(jié)果，使用western bo

14、lt法進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)各劑量的BBR均可以降低以上蛋白的過(guò)表達(dá)。其中，對(duì)于TGF-β1低劑量的BBR雖有降低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)于p-PKC-β的影響，中劑量的BBR效果最為明顯；BBR對(duì)于所有蛋白的影響，中劑量和高劑量的BBR效果均強(qiáng)于低劑量的BBR。
　　5. BBR對(duì)腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的影響
　　CCK-8細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DN狀態(tài)下系膜細(xì)胞過(guò)度增殖，而自15μmol/L開(kāi)始，BBR即具有顯著的抑制

15、系膜細(xì)胞增殖作用。BBR抑制系膜細(xì)胞過(guò)度增殖的IC50約為73μmol/L，根據(jù)此結(jié)果，設(shè)定后續(xù)系膜細(xì)胞的給藥濃度為30μmol/L，60μmol/L和90μmol/L。而對(duì)于足細(xì)胞，DN狀態(tài)下，足細(xì)胞數(shù)量減少明顯，當(dāng)BBR的濃度為60μmol/L時(shí)，足細(xì)胞的吸光度最高，在此濃度及之前，BBR具有顯著保護(hù)足細(xì)胞的作用；此后隨濃度增高，吸光度逐漸降低，推測(cè)可能是BBR的細(xì)胞毒性隨濃度增大而逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)生對(duì)足細(xì)胞的損傷。故對(duì)于足細(xì)胞的后續(xù)B

16、BR給藥濃度確定為30μmol/L，60μmol/L和90μmol/L。
　　6. VEGF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響
　　CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖和VEGF均能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞明顯過(guò)度增殖；當(dāng)VEGF濃度達(dá)到2ng/ml時(shí)，系膜細(xì)胞的增殖達(dá)到最高值，此后隨VEGF濃度增高，系膜細(xì)胞的增殖出現(xiàn)抑制。
　　7. BBR對(duì)大鼠血清和系膜細(xì)胞上清液中的AGEs含量的影響
　　ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，DN

17、模型大鼠血清和高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞上清液中AGEs含量明顯高于正常組；各劑量和濃度的BBR均具有顯著的抑制作用，其中，中劑量（濃度）和高劑量（濃度）組的BBR效果強(qiáng)于低劑量（濃度）組。
　　8. BBR對(duì)系膜細(xì)胞中AGEs-RAGE通路的影響
　　Western bolt法結(jié)果顯示，DN狀態(tài)下的系膜細(xì)胞AGEs、RAGE、p-PKC-β和TGF-β1的表達(dá)明顯高于正常組；不同濃度的BBR均具有顯著的抑制作用，其中，中濃度組的B

18、BR（60μmol/L）抑制效果最強(qiáng)。當(dāng)使用AGEs刺激系膜細(xì)胞后，RAGE、p-PKC-β和TGF-β1的表達(dá)顯著升高，但BBR此時(shí)無(wú)抑制作用；而阻斷劑Ab-RAGE能顯著降低p-PKC-β和TGF-β1的表達(dá)。激光共聚焦法結(jié)果顯示，RAGE在DN狀態(tài)下的系膜細(xì)胞上主要表達(dá)為膜性蛋白，此時(shí)細(xì)胞膜上RAGE表達(dá)明顯高于正常組，而B(niǎo)BR能夠有效的抑制膜性RAGE的過(guò)表達(dá)。
　　9. BBR對(duì)足細(xì)胞/系膜細(xì)胞之間VEGF-VEGFR2

19、通路的影響
　　蛋白芯片檢測(cè)足細(xì)胞上清液結(jié)果顯示，VEGF表達(dá)水平在DN狀態(tài)下顯著升高。Western bolt法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組足細(xì)胞分泌的VEGF蛋白相比正常組顯著升高，BBR給藥組可以有效降低VEGF的含量；高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞的p-VEGFR2相比正常組表達(dá)增多，而VEGF刺激后，系膜細(xì)胞的p-VEGFR2的表達(dá)升高更加明顯，不同濃度的BBR均有不同程度的改善作用。使用足細(xì)胞上清液刺激系膜細(xì)胞，p-VEGFR2的表達(dá)升高

20、顯著，中濃度的BBR和VEGF抑制劑均可以有效抑制p-VEGFR2的過(guò)表達(dá)。激光共聚焦法檢測(cè)結(jié)果顯示，足細(xì)胞中VEGF彌散性分布，為分泌性因子；系膜細(xì)胞中p-VEGFR2主要分布于細(xì)胞膜上，而B(niǎo)BR可以顯著性的降低VEGFR2的磷酸化。
　　結(jié)論：1. BBR可以有效的改善DN大鼠的腎功能，降低血糖，保護(hù)腎臟，改善DN大鼠的腎臟組織病理學(xué)。
　　2. DN狀態(tài)下AGEs-RAGE通路在大鼠腎臟中的下游因子包括PKC-β和TG