小檗堿通過(guò)EP4-Gαs-cAMP信號(hào)通路對(duì)不同階段糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　觀察小檗堿(berberine,BBR)對(duì)不同階段DN大鼠腎功能的保護(hù)作用,明確BBR在DN不同階段對(duì)大鼠腎臟功能及組織病變的作用特點(diǎn);通過(guò)檢測(cè)在DN不同階段時(shí)腎組織中PGE2、EP4、Gαs、cAMP的表達(dá)情況及BBR對(duì)他們的調(diào)控,來(lái)揭示BBR對(duì)DN大鼠腎臟功能發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　采用高糖高脂飲食合并小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)來(lái)誘導(dǎo)DN大鼠模型。腹腔注射

2、STZ72h后測(cè)定大鼠空腹血糖值,以血糖值≥11.1mol/L納入實(shí)驗(yàn),動(dòng)物被隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、3個(gè)BBR給藥組(50、100、200mg/kg)、依那普利、二甲雙胍、辛伐他汀陽(yáng)性藥對(duì)照組。采用灌胃給藥(intragastric administration,ig)每天一次并繼續(xù)喂以高糖高脂飼料,分別在2,4,6,8周觀察大鼠的一般狀況,體重每周一次稱(chēng)重,血糖每?jī)芍芤淮螠y(cè)量。在不同階段分別將大鼠置于代謝籠中,收集24h尿液;于

3、股動(dòng)脈采血后分離血清,分別檢測(cè)大鼠的24h尿蛋白總量(total urine protein for24 hours,UP24h)、尿肌酐(urine creatinine,UCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density l

4、ipoprotein-cholesterol,LDL-c)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low density lipoprotein-cholesterol,VLDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-c)。在不同階段分別取出大鼠腎臟并稱(chēng)重,計(jì)算其相對(duì)腎重(腎重/體重,KW/BW);觀察HE染色后腎臟組織病理學(xué)變化;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎皮質(zhì)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(t

5、ransforming growth factorβ1,TGF-β1);Western blotting法檢測(cè)腎皮質(zhì)中EP4、Gαs蛋白表達(dá)水平;ELISA法檢測(cè)腎組織中前列腺素E2(protaglandin E2,PGE2)和白細(xì)胞介素18(interleulkin-18,IL-18)的水平;放射免疫法檢測(cè)腎組織中cAMP和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor1,IGF-1)的水平。
　　結(jié)果

6、:
　　1.BBR對(duì)不同階段DN大鼠血糖和體重的影響
　　DN模型組大鼠的血糖水平較正常組顯著升高,BBR(100mg/kg,200mg/kg)從給藥第6周開(kāi)始,血糖較模型組顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);而 BBR(50mg/kg)給藥對(duì)DN大鼠血糖沒(méi)有明顯影響;二甲雙胍治療組從2周開(kāi)始也可顯著降低模型組的血糖水平。
　　模型組大鼠的體重從第2周開(kāi)始較正常對(duì)照組明顯降低;BBR給藥組及依那普利、二甲雙胍和

7、辛伐他汀治療組在給藥后,對(duì)模型組大鼠的體重均無(wú)明顯影響。
　　2.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎功能指標(biāo)及血生化指標(biāo)的影響
　　在不同階段,模型組大鼠的KW/BW比值、UCr、總蛋白/尿肌酐比值(UTP/C)、SCr、BUN、TG、TC、LDL-c、VLDL-c水平較正常對(duì)照組均明顯升高,而HDL-c水平明顯降低;從4周開(kāi)始,BBR(200mg/kg)可明顯改善 DN大鼠的腎功能和血生化指標(biāo)的異常,而B(niǎo)BR(100mg/kg)具

8、有顯著改善作用是從6周開(kāi)始,BBR(50mg/kg)則沒(méi)有明顯的改善作用。
　　3.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響
　　與正常組腎臟相比,模型組大鼠腎小球體積明顯增大,基底膜明顯增厚,部分腎小球已硬化,腎小管上皮細(xì)胞部分伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。3個(gè)BBR給藥組在2周時(shí)對(duì)模型組大鼠病變的腎臟無(wú)明顯影響;而從4周開(kāi)始BBR(200mg/kg)可明顯改善大鼠的病理變化;陽(yáng)性藥治療組對(duì)模型組大鼠腎臟也有類(lèi)似的改善作用。<

9、br>　　4.BBR對(duì)DN大鼠腎組織中TGF-β1表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示,模型組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)較正常組明顯升高,BBR(100mg/kg,200mg/kg)可顯著降低模型大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)。
　　5.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎臟IL-18表達(dá)的影響
　　ELISA法結(jié)果顯示,模型組大鼠IL-18水平較正常組顯著升高。BBR(200mg/kg)從4周開(kāi)始可明顯降低IL-18水平并具有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BBR(100mg/kg)從6周開(kāi)始可明顯降低IL-18水平并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而B(niǎo)BR(50mg/kg)對(duì)IL-18的表達(dá)水平并無(wú)明顯影響。
　　6.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎臟IGF-1水平的影響
　　放免法結(jié)果顯示,在各階段模型組大鼠IGF-1水平較正常組明顯升高。BBR(200mg/kg)從4周開(kāi)始可明顯下調(diào)IGF-1水平,BBR(100mg/kg)則從6周開(kāi)始才可明顯下調(diào)IGF-1水平,而B(niǎo)BR(50mg

11、/kg)對(duì)DN大鼠腎臟組織中IGF-1的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　7.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎臟PGE2表達(dá)的影響
　　ELISA法結(jié)果顯示,在各階段模型組大鼠PGE2水平較正常組顯著升高。BBR(200mg/kg)從4周開(kāi)始可明顯降低腎皮質(zhì)中PGE2的表達(dá)水平并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BBR(100mg/kg)從6周開(kāi)始可明顯降低腎皮質(zhì)中PGE2的水平并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而B(niǎo)BR(50mg/kg)對(duì)腎皮質(zhì)中PGE2的表達(dá)水平并無(wú)明

12、顯影響。
　　8.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎皮質(zhì)中EP4,Gαs蛋白表達(dá)的影響
　　Western blotting結(jié)果表明,與正常組大鼠比較,模型組大鼠腎皮質(zhì)中EP4、Gαs表達(dá)明顯降低,BBR給藥組在不同階段對(duì)腎皮質(zhì)中降低的EP4、Gαs蛋白表達(dá)水平有不同的影響:從4周開(kāi)始,BBR(200mg/kg)可明顯上調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì)中降低的EP4、Gαs蛋白表達(dá)水平,而B(niǎo)BR(100mg/kg)明顯上調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì)中降低的EP

13、4、Gαs蛋白表達(dá)水平是從6周開(kāi)始的,BBR(50mg/kg)對(duì)DN大鼠腎皮質(zhì)中EP4、Gαs蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　9.BBR對(duì)不同階段DN大鼠腎臟cAMP含量的影響
　　放免法結(jié)果顯示,在各階段模型組大鼠cAMP水平較正常組顯著下降。BBR(200mg/kg)從4周開(kāi)始可明顯上調(diào)cAMP水平,BBR(100mg/kg)則從6周開(kāi)始才可明顯上調(diào)cAMP水平,而B(niǎo)BR(50mg/kg)對(duì)DN大鼠腎臟組織中cAMP的表達(dá)

14、水平無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.BBR(100mg/kg,200mg/kg)給藥在不同階段使模型組血糖下降的程度不同;BBR(100mg/kg,200mg/kg)給藥在不同階段對(duì)模型組大鼠血生化和腎功能指標(biāo)的改善有所不同,提示BBR至少應(yīng)給藥4周以上才可以改善DN大鼠的疾病狀態(tài)。BBR(100mg/kg,200mg/kg)給藥可下調(diào)DN大鼠腎組織中TGF-β1、IL-18、IGF-1和PGE2的表達(dá),提示BBR對(duì)DN大

15、鼠腎臟的保護(hù)作用可能與其調(diào)節(jié)TGF-β1、IL-18、IGF-1和PGE2等因子有關(guān)。
　　2.BBR(100mg/kg,200mg/kg)給藥在不同階段調(diào)節(jié)DN大鼠腎皮質(zhì)中EP4、Gαs、cAMP的表達(dá)情況不同,BBR(200mg/kg)從第4周開(kāi)始可明顯上調(diào)腎皮質(zhì)中EP4、Gαs、cAMP的表達(dá),而B(niǎo)BR(100mg/kg)發(fā)揮同樣的作用是從6周開(kāi)始的,提示BBR可能是通過(guò)EP4-Gαs-cAMP信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)DN大鼠腎臟的