葡萄子原花青素B2抗內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷的作用機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分:GSPB2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷保護(hù)作用的研究
　　 研究背景:隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，生活方式的改變和社會(huì)人口老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。糖尿病不僅僅以持續(xù)性的高血糖為其特點(diǎn)，更重要的是高血糖所帶來(lái)的血管并發(fā)癥的損害。血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell

2、，VEC)是人體血管壁的第一道屏障，調(diào)節(jié)著血管的結(jié)構(gòu)和功能，VEC是最早受到高血糖影響的部位，高血糖可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和血管發(fā)生變化；大量的研究證實(shí)：內(nèi)皮功能障礙包括血管舒張因子與血管收縮因子、抗凝介質(zhì)與促凝介質(zhì)或生長(zhǎng)抑制因子與生長(zhǎng)促進(jìn)因子之間的不平衡在VR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。因此，血管早期損傷機(jī)制的闡明有助于預(yù)防或延緩糖尿病血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展，并且VEC作為血管重構(gòu)的干預(yù)點(diǎn)具有良好前景，開(kāi)辟新的糖尿病血管并發(fā)癥治療

3、途徑具有重要意義。
　　 葡萄子原花青素(grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)是從葡萄子中提取的一種天然多酚類(lèi)化合物，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑之一，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗非酶糖基化活性，并具有強(qiáng)效的心血管保護(hù)作用；其作為一種天然植物成分，無(wú)明顯的毒性反應(yīng)，在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用非常廣泛，其中二聚體在各類(lèi)原花青素中分布最廣，抗氧化活性最強(qiáng)。葡萄子原花青素B2(grape seed

4、procyanidin B2，GSPB2)是GSPE的主要成分，由兩個(gè)單體(兒茶素或表兒茶素)C4→C8鍵合而成的二聚體，在8種異構(gòu)體中原花青素B2的活性最強(qiáng)。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者一直致力于GSPE的作用機(jī)制研究。但是，至今尚未明確GSPB2對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究。在目前的研究中，觀察糖基化終末產(chǎn)物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響以及探討GSPB2對(duì)其的保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究乳凝集素(lactadherin)和糖原合

5、成酶激酶3β(GSK3β)信號(hào)通路在GSPB2抗內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷中的調(diào)節(jié)機(jī)制，將為防治糖尿病血管并發(fā)癥乃至多種涉及血管重構(gòu)的疾病開(kāi)辟新的途徑。
　　 研究目的:
　　 1.研究GSPB2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷的保護(hù)作用。
　　 2.研究GSPB2對(duì)乳凝集素和GSK3β表達(dá)的影響。
　　 研究方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，加入不同濃度的GSPB2(0.78、1.56、3.12、6.25、

6、12.50、25.00、50.00μmol/L)孵育48小時(shí)，應(yīng)用MTT和CCK-8比色法測(cè)定HUVEC的細(xì)胞生存率，從而確定實(shí)驗(yàn)中GSPB2的使用濃度。將GSPB2溶液加入HUVEC中，終濃度為(2.5、5.0、10.0μmol/L)，預(yù)孵育1小時(shí)，然后加入糖基化終末產(chǎn)物(AGE-BSA，200μg/ml)繼續(xù)共同培養(yǎng)至48h。應(yīng)用CCK-8比色法測(cè)定HUVEC的細(xì)胞生存率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的形成，實(shí)時(shí)

7、定量PCR或Western blot技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞lactadherin、cleaved caspase3、caspase3、磷酸化GSK3β(ser9)和總GSK3β的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.GSPB2對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響不同濃度的GSPB2孵育48小時(shí)后，HUVEC的細(xì)胞生存率在GSPB2濃度≤12.5μmol/L較正常細(xì)胞增加，GSPB2在濃度為6.25μmol/L時(shí)HUVEC細(xì)胞生存率較正常

8、顯著增加(P<0.05)。并且當(dāng)GSPB2濃度超過(guò)25.00μmol/L時(shí)HUVEC細(xì)胞生存率較正常顯著降低(P<0.05)。
　　 2.GSPB2對(duì)AGEs刺激HUVEC細(xì)胞存活率的影響與正常細(xì)胞組相比，AGEs顯著降低HUVEC的細(xì)胞存活率(P<0.01)。應(yīng)用不同濃度的GSPB2(2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC預(yù)孵育后，能夠顯著改善AGEs刺激HUVEC的細(xì)胞生存率(P<0.05或P<0.01)。

9、>　　 3.GSPB2對(duì)AGEs刺激HUVEC細(xì)胞凋亡的影響與正常細(xì)胞組相比，AGEs顯著增加HUVEC的細(xì)胞凋亡(P<0.01)。應(yīng)用不同濃度的GSPB2(2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC預(yù)孵育后，能夠顯著降低AGEs刺激HUVEC的凋亡(P<0.05)。
　　 4.GSPB2對(duì)AGEs刺激HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS的影響與正常細(xì)胞組相比，AGEs刺激HUVEC0.5小時(shí)后，顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS的形成(P<0.

10、05)。應(yīng)用不同濃度的GSPB2(2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC預(yù)孵育后，能夠呈劑量依賴性的顯著降低AGEs刺激HUVEC的ROS形成(P<0.05)。
　　 5.GSPB2對(duì)AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase3和lactadherin表達(dá)影響AGEs刺激HUVEC48小時(shí)后，cleaved caspase3和lactadherin蛋白表達(dá)與正常細(xì)胞相比顯著增加(P<0.05)。經(jīng)不同濃度

11、GSPB2預(yù)孵育后能夠顯著降低AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase3和lactadherin蛋白的表達(dá)，呈劑量依賴性(P<0.05)。同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCRN定各組細(xì)胞lactadherin mRNA的表達(dá)，AGEs刺激HUVEC48小時(shí)，lactadherin mRNA的表達(dá)也顯著增加(P<0.05)，GSPB2能夠劑量依賴性的抑制lactadherin mRNA的表達(dá)(P<0.05)。
　　 6.GSPB2

12、對(duì)AGEs刺激HUVEC的磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表達(dá)影響AGEs刺激HUVEC48小時(shí)后，磷酸化GSK3β(ser9)表達(dá)顯著降低(P<0.05)，經(jīng)不同濃度GSPB2預(yù)孵育后能夠顯著增加AGEs刺激HUVEC的磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.AGEs刺激HUVEC引起細(xì)胞凋亡，使lactadherin、cleaved caspase3表達(dá)增高，經(jīng)不同濃度GSPB

13、2預(yù)孵育，能夠抑制HUVEC損傷，起到保護(hù)作用。
　　 2.GSPB2保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷的分子機(jī)制：可能通過(guò)抑制lactadherin和增加磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分:Lactadlaerin介導(dǎo)的GSPB2抗內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷機(jī)制的研究
　　 研究背景:糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是體內(nèi)蛋白質(zhì)中賴氨酸的氨基部分、脂

14、類(lèi)或核酸與還原糖的羰基在無(wú)酶的條件下發(fā)生反應(yīng)，形成Schiff堿，經(jīng)Amadori反應(yīng)重排后形成的相對(duì)穩(wěn)定的糖基化產(chǎn)物。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血中AGEs水平明顯增高，且隨著病程的延長(zhǎng)AGEs濃度也逐漸增加。AGEs具有廣泛的生物學(xué)活性，參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。在血管壁的聚集直接參與了血管病變的形成。同時(shí)，AGEs還與血管壁細(xì)胞膜上AGEs受體結(jié)合，激活與血管損傷相關(guān)的機(jī)制，最終導(dǎo)致血管損傷。但是，AGEs導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損

15、傷機(jī)制尚未闡明。
　　 我們通過(guò)第一部分研究發(fā)現(xiàn)，AGEs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致乳凝集素(lactadherin)表達(dá)增高，經(jīng)GSPB2干預(yù)后其表達(dá)呈劑量依賴性降低；前期通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)：在糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織中l(wèi)actadherin表達(dá)顯著增加，經(jīng)GSPE干預(yù)后，其在主動(dòng)脈組織中表達(dá)明顯降低。乳凝集素又稱(chēng)為乳脂肪球表皮生長(zhǎng)因子8(MFG-E8)是乳汁脂肪小球表面的親脂性糖蛋白，在機(jī)體其他體液中也有表達(dá)，發(fā)揮多種

16、功能，并與體內(nèi)多種細(xì)胞的整合素受體結(jié)合，引發(fā)粘附、分化、增殖、凋亡、細(xì)胞骨架重排、激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。它主要分布于乳小管頂端的分泌上皮，并在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)；并且也存在于胰腺、主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等。本研究首先構(gòu)建lactadherin過(guò)表達(dá)慢病毒載體和siRNA，轉(zhuǎn)染HUVEC后，并應(yīng)用GSPB2干預(yù)，測(cè)定干預(yù)前后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡變化，并應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)lactadherin、cleaved caspase3

17、、Bax/Bcl-2和磷酸化GSK3B(ser9)表達(dá)變化。
　　 研究目的:
　　 1.研究lactadherin siRNA和過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷的影響。
　　 2.研究GSPB2抗內(nèi)皮細(xì)胞糖基化損傷的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 研究方法:體外培養(yǎng)HUVEC，構(gòu)建lactadherin siRNA和過(guò)表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)染HUVEC后，傳代擴(kuò)增。將轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照和lactadherin siRNA的HUVE

18、C分別加入糖基化終末產(chǎn)物(AGE-BSA，200μg/ml)繼續(xù)共同培養(yǎng)至48h，陰性對(duì)照同時(shí)加入GSPB2(10.00μmol/L)共孵育；另外，將lactadherin過(guò)表達(dá)的HUVEC，加入GSPB2(10.00μmol/L)孵育48小時(shí)，應(yīng)用MTT和CCK-8比色法測(cè)定各組細(xì)胞生存率，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并收集lactadherin過(guò)表達(dá)的HUVEC，各組細(xì)胞應(yīng)用電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR或Western

19、 blot技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞lactadherin、cleaved caspase3、磷酸化GSK3β和線粒體凋亡通路Bax/Bcl-2表達(dá)變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.Lactadherin siRNA和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染HUVEC的有效性轉(zhuǎn)染的有效性應(yīng)用熒光顯微鏡、實(shí)時(shí)定量PCR和western blot技術(shù)評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(NC)、lactadherin siRNA組(LsiRNA)、表達(dá)GFP基因組(LV-C)和

20、GFP及l(fā)actadherin過(guò)表達(dá)組(LV)，收獲各組細(xì)胞。轉(zhuǎn)染有效性約為95％，lactadherin siRNA在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)LsiRNA lactadherin蛋白表達(dá)較NC降低60％以上；lactadherin過(guò)表達(dá)在轉(zhuǎn)染5天后，lactadherin蛋白表達(dá)量較LV-C增加超過(guò)2倍。
　　 2.Lactadherin對(duì)AGEs刺激HUVEC細(xì)胞生存率的影響及GSPB2干預(yù)作用HUVEC轉(zhuǎn)染GFP基因或陰性對(duì)照并未影

21、響細(xì)胞生存率。AGEs(200μg/ml)刺激各組細(xì)胞48小時(shí)，與AGEs刺激NC組細(xì)胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞生存率的降低(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)也能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞生存率的降低(P<0.05)。另外，轉(zhuǎn)染5天后，LV組細(xì)胞生存率較LV-C組顯著降低(P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)能夠顯著改善LV組細(xì)胞生存率(P<0.05)。

22、>　　 3.Lactadherin對(duì)AGEs刺激HUVEC細(xì)胞凋亡的影響及GSPB2干預(yù)作用AGEs(200μg/ml)刺激各組細(xì)胞48小時(shí)后，與AGEs刺激NC組細(xì)胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)也能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)。另外，轉(zhuǎn)染5天后，LV組細(xì)胞凋亡較LV-C組顯著增加(P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共

23、孵育48小時(shí)能夠顯著改善LV組細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
　　 4.Lactadherin過(guò)表達(dá)HUVEC超微結(jié)構(gòu)的改變透射電鏡掃描觀察Lactadherin過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染5天后及GSPB2共孵育48小時(shí)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，LV組細(xì)胞凋亡顯著增加，可見(jiàn)凋亡小體、線粒體偏極化、細(xì)胞染色質(zhì)固縮及染色體聚集于核膜呈境界分明塊狀等變化，GSPB2共孵育后細(xì)胞凋亡顯著減輕。
　　 5.Lactadherin對(duì)AGEs刺激HUVEC的cl

24、eaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值影響及GSPB2干預(yù)作用LV-C組、LV組、LsiRNA組和NC組細(xì)胞uncleaved caspase-3表達(dá)未見(jiàn)顯著變化。AGEs(200μg/ml)刺激各組細(xì)胞48小時(shí)后，與AGEs刺激NC組細(xì)胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)也能夠顯著

25、改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)。另外，轉(zhuǎn)染5天后，LV組細(xì)胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值較LV-C組顯著增加(P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)也能夠顯著改善LV組細(xì)胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)。
　　 6.Lactadherin對(duì)AGEs刺激HUV

26、EC磷酸化GSK3β(ser9)的影響及GSPB2干預(yù)作用AGEs(200μg/ml)刺激各組細(xì)胞48小時(shí)后，與AGEs刺激NC組細(xì)胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)也能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細(xì)胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)。另外，轉(zhuǎn)染5天后，LV組細(xì)胞磷酸化GSK3β(ser9)較LV-C組顯著降低(

27、P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時(shí)能夠顯著改善LV組細(xì)胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Lactadherin在AGEs誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。
　　 2.Lactadherin介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與線粒體凋亡通路和GSK3β(ser9)的磷酸化有關(guān)。
　　 3.抗氧化劑GSPB2通過(guò)抑制Lactadherin表達(dá)起