TAT-LMP-3融合蛋白的制備及其誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究.pdf

1、脊柱融合術(shù)被廣泛應(yīng)用于退行性病變、創(chuàng)傷、腫瘤等各種脊柱疾患的治療中，是脊柱外科手術(shù)中最常用技術(shù)之一。但仍有最多高達(dá)45％的患者發(fā)生假關(guān)節(jié)形成，同時(shí)自體髂骨植骨增加了手術(shù)創(chuàng)傷并帶來(lái)了相關(guān)并發(fā)癥。進(jìn)一步提高脊柱融合率和尋找更為合適的移植替代物，成為脊柱外科的研究熱點(diǎn)。 在對(duì)成骨的分子機(jī)制的研究過程中，逐漸發(fā)現(xiàn)了一系列生物因子對(duì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和促進(jìn)局部骨形成有著重要的作用，這些因子被稱為骨誘導(dǎo)因子。許多骨誘導(dǎo)因子被發(fā)現(xiàn)、研究并應(yīng)用于

2、脊柱融合術(shù)。BMPs是現(xiàn)在研究最多的骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子。研究證實(shí)rhBMP-2的應(yīng)用增加了脊柱融合幾率并減少了自體骨移植所帶來(lái)的手術(shù)創(chuàng)傷。但rhBMP-2價(jià)格昂貴并有明確的劑量依賴性，常需要使用毫克級(jí)別的重組蛋白才能達(dá)到滿意的臨床療效。 LIM礦化蛋白(LIMmineralizationproteinLMP)是近期發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化成熟的胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)因子，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成，在骨的礦化過程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，LMP

3、體外和體內(nèi)可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7以及TGF-β等多種骨誘導(dǎo)因子的分泌，同時(shí)提高成骨相關(guān)細(xì)胞對(duì)外源性BMPs的反應(yīng)性，招募周圍細(xì)胞參與成骨。相關(guān)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)體內(nèi)異位成骨和脊柱融合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，LMP-1的效能強(qiáng)于BMP-2。將LMP作為目的基因的局部基因治療中發(fā)現(xiàn)：不需要轉(zhuǎn)染每一個(gè)受體細(xì)胞，也不需要長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)就可以產(chǎn)生較強(qiáng)的成骨效應(yīng)，故LMP較BMPs等更適合于脊柱融合的治療。上述研究表

4、明LMP-3和LMP-1可以作為BMPs類理想的替代物，有望避免了大劑量單一應(yīng)用BMPs的不便之處，并產(chǎn)生更大的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)。 迄今已分離出3種LMP基因型，Boden等對(duì)LMP同源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)：hLMP-1長(zhǎng)457個(gè)氨基酸，包含1個(gè)PDZ功能區(qū)(N端)和3個(gè)LIM功能區(qū)(C端)，hLMP-2長(zhǎng)423個(gè)氨基酸，包含完整的PDZ功能區(qū)和LIM功能區(qū)，hLMP-3長(zhǎng)153個(gè)氨基酸，包含1個(gè)完整PDZ功能，LI

5、M功能區(qū)缺失。研究證實(shí)，hLMP-2擁有完整的LIM功能區(qū)但沒有促進(jìn)成骨作用，hLMP-3沒有LIM功能區(qū)卻具備與hLMP-1類似的誘導(dǎo)成骨能力。對(duì)LMP的分析揭示：LMP-1和LMP-3共有一個(gè)，40aa的獨(dú)特區(qū)域顯示出與成骨作用密切相關(guān)。 LMP作為胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，目前均采用質(zhì)粒、腺病毒等基因治療的方式導(dǎo)入編碼cDNA以過度表達(dá)的方式實(shí)現(xiàn)其研究和應(yīng)用?；蛑委煂?dǎo)入效率偏低，且存在安全問題，有引起插入突變及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在

6、危險(xiǎn)。構(gòu)建具有入胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力并保持成骨活性的LMP重組蛋白，有望大大拓寬LMP的應(yīng)用范圍，并使LMP的實(shí)際臨床應(yīng)用成為可能。 1988年Green和Frankle發(fā)現(xiàn)人免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白(tat)能介導(dǎo)自細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，后續(xù)對(duì)tat蛋白的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)tat49-57(RKKRRQRRR)9肽序列是其主要功能區(qū)，也是保持tat蛋白功能活性的最小片斷。在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系

7、列短肽具有相似的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，這類短肽被統(tǒng)稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomains，PTDs)。PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)可介導(dǎo)包括蛋白在內(nèi)的多種生物大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，且不受細(xì)胞類型的限制，并有望保持被轉(zhuǎn)運(yùn)分子的生物活性，在生物細(xì)胞學(xué)研究和藥物開發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。PTD介導(dǎo)的入胞轉(zhuǎn)導(dǎo)存在明顯的優(yōu)勢(shì)：(1)PTD能快速有效的將攜帶物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；(2)對(duì)活體細(xì)胞干擾小，絕大部分PTD復(fù)合物在一定濃度內(nèi)基本無(wú)毒性；(3)

8、應(yīng)用上操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，大多情況下能保持?jǐn)y帶物質(zhì)的生物學(xué)活性，低濃度即可發(fā)揮有效生物學(xué)效能。 如前所述，TatPTD具有高效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，我們?cè)O(shè)想將tat49-57(RKKRRQRRR)9肽序列與LMP-3進(jìn)行連接，構(gòu)建TAT/LMP-3融合蛋白，利用TatPTD將LMP-3介導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化的潛能，是組織工程常用的種子細(xì)胞，其本身亦可向成

9、骨細(xì)胞分化，具有來(lái)源廣泛、取材方便、增殖和分化能力強(qiáng)、能與宿主骨良好結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中采用重組蛋白與人MSCs共培養(yǎng)的方法來(lái)驗(yàn)證Tat序列誘導(dǎo)入胞的能力和TAT/LMP-3融合蛋白促成骨分化的活性。同時(shí)，我們制備重組蛋白LMP-3作為對(duì)照。 本課題的研究主要包括以下三個(gè)部分，所用到的主要方法及結(jié)果如下： 第一部分：TAT/LMP-3融合蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備 1.人工合成針對(duì)大腸桿菌表達(dá)體系優(yōu)化的

10、LMP-3編碼基因序列，通過PCR方法分別獲得TAT/LMP-3融合基因和LMP-3基因并引入酶切位點(diǎn)。通過酶切、連接構(gòu)建原核表達(dá)載體，命名為pET43.1a-TAT/LMP-3和pET43.1a-LMP-3。測(cè)序結(jié)果提示無(wú)PCR引起的突變，基因無(wú)移碼，質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.將構(gòu)建載體于BL21(DE3)工程菌中進(jìn)行原核表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件后目的蛋白表達(dá)以可溶性表達(dá)為主，將表達(dá)產(chǎn)物上清經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后，獲得重組蛋白TAT/L

11、MP-3和LMP-3，純度均在90％以上。 3.將重組蛋白LMP-3免疫家兔獲得多抗血清，經(jīng)飽和硫酸銨法純化獲得多克隆抗體。ELISA法檢測(cè)其對(duì)TAT/LMP-3和LMP-3的效價(jià)均在1:4000以上，western-blot分析提示抗體與重組蛋白有較好的抗原抗體反應(yīng)性和一定特異性。 第二部分：人骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 1.本部分實(shí)驗(yàn)中通過梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離獲得人骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs

12、)，流式細(xì)胞儀分析第三代hMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)情況，結(jié)果陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD105，CD34和CD45表達(dá)為陰性，細(xì)胞純度達(dá)到95％以上。 2.在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C50mg/L)誘導(dǎo)下，hMSCs堿性磷酸酶活性增高，Ⅰ型膠原基因表達(dá)上調(diào)，放免法檢測(cè)骨鈣素表達(dá)增高。14d后茜素紅S染色提示鈣結(jié)節(jié)形成，證實(shí)hMSCs在適當(dāng)條件可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。 第

13、三部分：TAT/LMP-3融合蛋白誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究 1.將TAT/LMP-3和LMP-3分別與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共孵育，通過間接免疫熒光染色和western-blotting技術(shù)檢測(cè)重組蛋白的入胞效應(yīng)。結(jié)果TAT/LMP-3能以濃度/時(shí)間依賴的方式，高效快速的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。對(duì)照蛋白LMP-3不具備入胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。 2.將純化重組蛋白分別與人骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞共孵育，檢測(cè)重組蛋白對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分