腺病毒介導(dǎo)的Apelin基因過(guò)表達(dá)對(duì)糖尿病大鼠心梗后心臟功能的保護(hù)作用和其機(jī)制研究.pdf

1、隨著生活水平高,糖尿病發(fā)病率也在增高,其心血管并發(fā)癥多,特別是糖尿病合并心肌梗死,比非糖尿病合并心肌梗死更加嚴(yán)重,死亡率更高,心功能更差。和非糖尿病對(duì)比,研究糖尿病合并心肌梗死特有的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn),并進(jìn)一步探討有效的治療方法,意義重大。Tatamoto于1998年分離發(fā)現(xiàn)一種新的心血管活性多肽Apelin,其與血管緊張素Ⅱ具有同源性,屬于腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的新組分。研究發(fā)現(xiàn),Apelin具有擴(kuò)血管、增強(qiáng)心肌收縮力、促進(jìn)一

2、氧化氮(NO)合成和調(diào)節(jié)胰島素抵抗等作用。糖尿病合并心肌梗死恰巧既有胰島素抵抗,又有心臟病變,那么Apelin是否對(duì)其有更加顯著的保護(hù)作用?尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文利用腺病毒介導(dǎo)Apelin基因過(guò)表達(dá),和非糖尿病心梗大鼠對(duì)比,研究Apelin對(duì)糖尿病大鼠心梗后心臟功能的影響和其部分機(jī)制進(jìn)行研究。本工作由以下三部分組成:
　　 一、糖尿病和非糖尿病大鼠心肌梗死后在心臟功能、凋亡和自身分泌的APelin多肽水平等方面的對(duì)比研究
　　

3、 目的:既往研究證實(shí),無(wú)論是非糖尿病大鼠還是糖尿病大鼠,發(fā)生心肌梗死后心臟功能發(fā)生明顯變化；心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加；自身分泌的APelin多肽水平前期增多,晚期下降。但是糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠對(duì)比,二者心梗后在心臟功能、凋亡和自身分泌的APelin多肽水平方面有何區(qū)別,程度和機(jī)制如何,尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 方法:1.STZ注射誘導(dǎo)制備DM大鼠模型。2.DM大鼠和非DM大鼠均隨機(jī)分為兩組組,其中一組行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),另一組為假

4、手術(shù)組。左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制備急性心肌梗死模型。3.多普勒超聲心動(dòng)圖測(cè)定左心室舒張末期及收縮末期內(nèi)徑(LVIDd,LVIDs)及室間隔舒張末期及收縮末期厚度(IVSd,IVSs)和左心室舒張末期及收縮末期后壁厚度(LVPWd,LVPWs),應(yīng)用CUBED公式法計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(EF,％)及左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS,％)。4.血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定左心室收縮期壓力(LVSP)、左心室舒張末壓力(LVEDP)、左心室內(nèi)壓的最大變化速率(±dp／dtm

5、ax)等指標(biāo)。5.采用美國(guó)Roche proBNP試劑盒,運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(ECLIA在Roche Elecsys2010上測(cè)定大鼠血漿NT-proBNP。6.采用TUNEL法標(biāo)記大鼠左心室非梗死區(qū)凋亡的心肌細(xì)胞核。7.RT-PCR方法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3的mRNA表達(dá)。8.Western blot方法檢測(cè)Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)。9.免疫組化法測(cè)定心肌Apelin。10.酶聯(lián)免疫法測(cè)

6、定血漿中的Apelin。
　　 結(jié)果:1.糖尿病心梗組和非糖尿病心梗組相比,LVIDd,LVIDs和LVPWs明顯升高,心力衰竭大鼠加重,心腔明顯擴(kuò)大,左室后壁收縮期厚度明顯增加,EF和FS顯著降低,大鼠心功能明顯下降。2.糖尿病心梗組和非糖尿病心梗組相比,LVEDP明顯升高,LVSP和LVdp／dtmax顯著降低,提示大鼠心功能明顯下降。3.糖尿病心梗組死亡率高于非糖尿病心梗組。4.糖尿病心梗組比非糖尿病心梗組大鼠心肌梗死面積

7、明顯增加。5.糖尿病心梗組比非糖尿病心梗組血漿NT-proBNP濃度明顯升高。6.DM心梗組比非DM心梗組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高。7.心梗后的糖尿病大鼠比心梗后的非糖尿病大鼠的Bax和caspase-3表達(dá)增高,Bcl-2表達(dá)降低。8.在未發(fā)生心梗前,同非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠APelin多肽水平明顯高,說(shuō)明糖尿病本身的內(nèi)分泌代謝紊亂也可以引起APelin升高。但心梗后,糖尿病大鼠APelin多肽水平很快下降,開始下降的時(shí)間點(diǎn)早于非糖

8、尿病大鼠,下降的幅度大于非糖尿病大鼠,晚期的絕對(duì)值低于非糖尿病大鼠
　　 結(jié)論:和非糖尿病大鼠對(duì)比,糖尿病大鼠心梗后心臟功能明顯惡化,心梗面積增大,死亡率增加,凋亡心肌細(xì)胞數(shù)目顯著增加,Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)增高,Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)降低。自身分泌的APelin多肽水平下降更快,下降時(shí)間點(diǎn)提前。表明糖尿病大鼠心梗后病情更加危重,糖尿病已經(jīng)對(duì)心臟功能產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響,出現(xiàn)心梗后病情疊加,病變更加顯

9、著。
　　 二、腺病毒介導(dǎo)的Apelin基因過(guò)表達(dá)對(duì)糖尿病和非糖尿病大鼠心梗后心臟功能、結(jié)構(gòu)和凋亡的影響。
　　 目的:研究發(fā)現(xiàn),Apelin具有擴(kuò)血管、增強(qiáng)心肌收縮力、促進(jìn)一氧化氮(NO)合成和調(diào)節(jié)胰島素抵抗等作用。糖尿病合并心梗恰巧既有胰島素抵抗,又有心臟病變,那么Apelin是否對(duì)其有更加顯著的保護(hù)作用?尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。在本工作第一部分研究基礎(chǔ)上,利用腺病毒介導(dǎo)的Apelin基因過(guò)表達(dá),做進(jìn)一步探討。
　　

10、方法:1.將非DM和DM心梗大鼠模型組隨機(jī)分為4個(gè)亞組:1)空白對(duì)照組,心衰大鼠尾靜脈注射生理鹽水500μ；2)病毒對(duì)照組Ad-GFP,心衰大鼠尾靜脈注射Ad-GFP500μl；3)治療組Ad—Apelin,心衰大鼠尾靜脈注射Ad-Apelin500μl；4)假手術(shù)組,尾靜脈注射生理鹽水500μl。2.多普勒超聲心動(dòng)圖測(cè)定左心室舒張末期及收縮末期內(nèi)徑(LVIDd,LVIDs)及室間隔舒張末期及收縮末期厚度(IVSd,IVSs)和左心室舒

11、張末期及收縮末期后壁厚度(LVPWd,LVPWs),應(yīng)用CUBED公式法計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(EF,％)及左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS,％)。3.血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定左心室收縮期壓力(LVSP)、左心室舒張末壓力(LVEDP)、左心室內(nèi)壓的最大變化速率(±dp／dt max)等指標(biāo)。4.采用美國(guó)Roche proBNP試劑盒,運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(ECLIA在Roche Elecsys2010上測(cè)定大鼠血漿NT-proBNP。5.每周應(yīng)用BP-9

12、8A動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(日本Softron公司),采用tail-cuff去測(cè)量收縮壓。每次測(cè)量時(shí)血壓平穩(wěn),即兩次測(cè)量值相差小于5mmHg后連續(xù)測(cè)量3次,取其平均值。6.測(cè)量心臟肥厚指數(shù)(HWI),HWI=心臟質(zhì)量量／體質(zhì)量。7.光鏡和電鏡觀察心肌形態(tài)學(xué)變化。8.測(cè)定PPARα9.測(cè)定CVF。10.采用TUNEL法標(biāo)記大鼠左心室非梗死區(qū)凋亡的心肌細(xì)胞核。11.RT-PCR方法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3的mRNA表達(dá)。12

13、.Western blot方法檢測(cè)Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.超生心動(dòng)顯示,糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,心功能改善更加顯著。2.血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)顯示,糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,心功能改善更加顯著。3.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,大鼠血漿NT-proBNP濃度下降更加顯著。4.糖尿病Apelin治療組和非糖尿

14、Apelin治療組相比,大鼠收縮壓降低比例更加顯著。5.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,大鼠梗死面積減少比例更加顯著。6.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,心臟肥厚指數(shù)減少比例更加顯著。7.光鏡和電鏡觀察,DM和非DM大鼠Apelin治療后形態(tài)明顯改善,其中糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,形態(tài)改善更加顯著。8.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,減

15、少比例更加顯著。9.DM大鼠心梗后APLIN治療組比非DM大鼠心梗后APLIN治療組PPARα陽(yáng)性表達(dá)含量高。10.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,凋亡指數(shù)減少比例更加顯著。11.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)減少比例更加顯著；Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)增加比例更加顯著。
　　 結(jié)論:和非糖尿病心梗大鼠Apelin治療對(duì)比,糖尿病

16、心梗大鼠Apelin治療后心臟功能和形態(tài)改善更加明顯,血壓、心臟肥厚指數(shù)、心臟CVF比例、凋亡指數(shù)和促凋亡基因Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)下降比例更加顯著,抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)增加比例更加顯著。表明Apelin治療作用對(duì)糖尿病心梗大鼠更加顯著,可能與Apelin既能擴(kuò)血管、增強(qiáng)心肌收縮力、促進(jìn)一氧化氮(NO)合成,又能調(diào)節(jié)胰島素抵抗。同時(shí)改善心血管和糖尿病的病情。其部分機(jī)制與其降低氧化應(yīng)激,減少心

17、肌細(xì)胞凋亡有關(guān)系。
　　 三、腺病毒介導(dǎo)的Apelin基因過(guò)表達(dá),對(duì)糖尿病和非糖尿病大鼠心梗后心臟保護(hù)作用的部分通道機(jī)制研究。
　　 目的:研究發(fā)現(xiàn),PI3K、PKB和eNOS通道激活可以促進(jìn)NO分泌引起血管舒張,降低血壓,改善血供；P38MAPK通道與心臟疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本工作第一和第二部分研究表明,Apelin具有改善心功能,舒張血管和減低心肌細(xì)胞凋亡等作用。那么Apelin是否是通過(guò)上述通道發(fā)揮作用,情況如

18、何?尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。在本工作前兩部分研究基礎(chǔ)上,利用腺病毒介導(dǎo)的Apelin基因過(guò)表達(dá),利用RT-PCR和Western blot等技術(shù),應(yīng)用p38MAPK特異性阻斷劑SB203580,從分子生物學(xué)水平做進(jìn)一步探討。
　　 方法:1.RT-PCR方法檢測(cè)PI3K、PKB、eNOS、P38MAPK、Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)。2.Western blot方法檢測(cè)p38MAPK,PI3K、PKB、Bcl-2、

19、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)。3.Griess重氮化反應(yīng)法測(cè)定NO2含量,用722分光光度儀在540nm處測(cè)定,然后根據(jù)公式計(jì)算出NO2含量以此來(lái)反映上清液NO濃度。4.免疫組化測(cè)定eNOS。5.采用TUNEL法標(biāo)記大鼠左心室非梗死區(qū)凋亡的心肌細(xì)胞核。6、應(yīng)用p38MAPK特異性阻斷劑SB203580阻斷p38MAPK通道。
　　 結(jié)果:1.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,PI3K、PKB和eNO

20、S的mRNA和蛋白表達(dá)升高比例更加顯著。2.糖尿病.Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,P38MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)下降比例更加顯著。3.糖尿病Apelin治療組和非糖尿Apelin治療組相比,動(dòng)脈內(nèi)皮NO濃度和eNOS免疫組化陽(yáng)性表達(dá)升高比例更加顯著。4.糖尿病SB治療組和非糖尿SB治療組相比,凋亡指數(shù)減少比例更加顯著。5.糖尿病SB治療組和非糖尿SB治療組相比,Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)減少比

21、例更加顯著:Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)增加比例更加顯著。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P38MAPK通道特異性阻斷劑SB203580對(duì)心梗誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡有明顯的抑制作用。Apelin可以通過(guò)激活PI3K、PKB和eNOS通道的表達(dá),促進(jìn)NO分泌,引起血管舒張,降低血壓,改善血供；并通過(guò)抑制P38MAPK通道表達(dá),降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。與心梗后的非糖尿病大鼠相比較,以上作用對(duì)心梗后的糖尿病大鼠更加顯著。表明心梗后的糖尿病